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1、细胞核与线粒体的分级分离,1.初步了解细胞内各种成分的分离方法 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。,一、实验目的,细胞器分离基本步骤,二、实验原理,细胞破碎,分离、纯化,细胞器鉴定,（一）细胞破碎的方法1.杆状玻璃匀浆器法2.高速组织捣碎机法3.超声波处理法4.化学裂介法5.反复冻融法,二、实验原理,细胞破碎的注意事项：1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在的条件下细胞器不易发生聚集。2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。3、若是采用低
2、渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。,（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。,二、实验原理,差速离心法,根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍
3、及以上）的颗粒。优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复悬浮和离心加以纯化。壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。,密度梯度离心,下次课讲,（三）细胞器的鉴定分析 分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
4、（也可使用罗丹明123或MitoTracker等荧光探针标记法等）细胞核：DNA亚甲基蓝、甲苯胺蓝、Hoechst染料等,方法和步骤,（一）细胞核的分离提取 1、肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。2、称取肝组织1 g，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖-0.05molL Tris-HCI缓冲液，pH7.4（0.25moll蔗糖0.003moll氯化钙）溶液洗涤数次。,3、按每克肝加8ml-9ml预冷的0.25molL蔗糖 0.05m/L Tris-HCI溶液，用高速组织匀浆器匀浆（已完成）4、取一定量匀浆液，在04
5、冰浴中用玻璃匀浆器将肝再次匀浆（匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨）（因已事先匀浆，本步骤研磨次数和时间可缩短）5、肝匀浆用双层纱布过滤，滤液制一张涂片,自然干燥.,6、滤液以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。,7、用6ml 蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片，自然干燥。8、将、涂片用l甲苯胺兰（或亚甲基蓝
6、）染色后盖片即可观察。,（二）高速离心分离提取线粒体1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000g离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。（本实验用12000rpm,非冷冻离心）2、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用吸管吹打成悬液，以17000g离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。,3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记、涂片)，各滴一滴1詹纳斯绿b染液染20分钟,盖片观察。4、油镜观察。,注意事项,1、各步骤加入的溶液的量需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。3、本实验所有操作本应在低温下进行，但实验室的冷冻离心机损坏，用普通离心机离心，温度和转速都和实验步骤有差别。,实验报告,方法：按照实际的操作记录结果：描述5张涂片镜下情况讨论：1、实际情况和理论预期是否符合？为什么？2、本实验步骤有哪些可以改进的地方？,
