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1、细胞重组与克隆技术,王芳吉林大学药学院,首个人造细胞,一、细胞重组：1、定义：从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。,2、特点与意义：是离体的装配过程；技术基础是核、质分离技术和细胞融合技术的发展；研究核、质相互关系；揭示细胞活动规律。,二、细胞重组技术：（一）几个定义：胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。微质体：植物去核原生质。核体：在细胞去核过程中，分离出的核带有少量胞质并围有质膜称为核体。微细胞（微核体）：指含有一条或几条染色体（即只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整
2、质膜的核质体。,（二）细胞重组的几种形式：（1）胞质杂种（2）微细胞异核体（3）重组细胞（核移植技术）：将一个细胞的核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。,（三）细胞和细胞器的分离技术 1、分离依据:细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、荧光强弱、对其他介质的吸附2、分离方法：沉降法细胞电泳 流式细胞仪,（1）速度沉降 速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。,（2）等密度沉降 等密度沉降（isopycnicsedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细
3、胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。,等密度沉降通常在较高密度的介质中进行，需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。,（3）细胞电泳 在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（cellelectrophoresis）。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。不同类型
4、的细胞在电场中的泳动速度不同，可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。,（3）流式细胞术 是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。,3、细胞破碎获得细胞器的技术 超声波破碎法 反复冻融法 化学裂解法 高速组织捣碎法,细胞重组,（四）细胞拆合的方法
5、1、物理拆合法:显微操纵术发展过程：缺点：（1）费时耗力（2）得到的去核细胞胞质内成分不完全（3)不能一次性的提供大量的去核细胞 2、化学拆合法：细胞松弛素,细胞重组,性质：不溶于水，易溶于二甲亚砜和纯乙醇生物学效应：1.干扰细胞质的分裂；2.引起细胞表面形状的改变，排出细胞核；3.抑制细胞运动；4.妨碍细胞的吞噬作用。5.不影响细胞内DNA、RNA和蛋白质的合成6.作用是可逆的,（五）各种重组细胞的制备：1、胞质体制备方法：借助细胞松弛素的排核作用，结合高速离心得到了胞质体。根据细胞中各组分(如细胞核、细胞器)具有不同的密度，在密度梯度溶液中高速离心后将分层，含核的部分密度高，沉于管底，低密
6、度的胞质部分则浮于上层。,细胞重组,细胞重组,细胞重组,卵母细胞去核前后Hoechst33342 染色（放大倍数 100倍）,胞质体能在体外正常培养条件下，存活1636小时，并呈现贴壁、铺展及运动等行为。电镜观察表明，胞质体内的细胞器与完整细胞相同，并占有各自固定的位置。说明去核胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品，胞质杂种细胞是不同种系之间的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功地生存下去。,2、核体制备 防止夹杂完整细胞和胞质体。1.预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。2.可在去核处理后，收集样品，接种于培养皿内，温育l-2h，重复l-2次，可从上清液中收集得到较纯净的核体。3.采用梯度密度
7、离心法，去除胞质体。可使核体的纯度高达99。,细胞重组,核质与胞质分离的情况,3、微细胞 秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含有一个或数个染色体的DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材料。,（六）动物细胞的重组及细胞质杂交 用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加人病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。,
