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1、第八章 细菌感染的检查方法与防治原则,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),标本的采集和运送,避免杂菌污染,运送注意保存,不同期不同标本,用抗菌素以前,采集病变明显部位,标本必须新鲜,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),药物敏感试验,标本,直接涂片镜检,分离培养,生化试验,血清学试验,动物试验,明确诊断,初步诊断,分子生物学技术,其他检测技术,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),形态与结构的检查,细菌个体形态与结构的检查,细菌的菌体形态、排列、染色
2、性,染色单染：复染：特殊染色：,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),形态与结构的检查,医学意义：1、鉴定细菌 2、与致病性有关 3、参考选择抗菌药物,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),形态与结构的检查,抗酸染色（acid-fast stain）方法：1、石炭酸复红初染：加热35min，水洗 2、3%5%盐酸酒精脱色30s，水洗 3、碱性美蓝复染30s，水洗。4、干后镜检,结果：抗酸杆菌 红色 非抗酸杆菌 蓝色,原理：分枝杆菌属的细菌，胞壁脂质多，其中的分枝菌酸与石炭酸复红结合成牢固的复合物，能
3、抵抗脱色。,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),分离与鉴定,分离：固体平板 分区划线法 单个菌落 菌落形态：大小、光滑度、透明、溶血性,鉴定：,形态特征生化反应血清学鉴定动物试验药物敏感试验,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis)常见生化反应,第一节 细菌学诊断,细菌学诊断(bacteriological diagnosis),抗原的检测,优点：分离、培养细菌困难的情况下；已经使用了抗生素、细菌已被抑制/杀死；可检测微量的抗原,常用方法：,沉淀反应 协同凝结试验 免疫荧光法 对流免疫电泳 酶免疫法
4、免疫印迹法,第一节 细菌学诊断,血清学诊断(serological diagnosis),抗体的检测,原理：用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。,原则：双份血清；与该地区的抗体效价的正常值比较；恢复期血清中抗体效价比急性期血清中抗体效价升高4倍者,第一节 细菌学诊断,血清学诊断(serological diagnosis),抗体的检测,常用方法：,凝集试验：,补体结合试验：,中和试验：,肥达试验、外斐试验、显微镜凝集试验等,抗“O”试验等,Q热柯克斯体抗体检测等,第二节 细菌性感染的特异性预防,获得性免疫的产生的方式 自然主
5、动免疫：患病、隐性感染 主动免疫 人工主动免疫：接种疫苗、类毒素等 自然被动免疫：通过胎盘、初乳被动免疫 人工被动免疫：注射抗毒素、丙种球蛋 白、转移因子,第二节 细菌性感染的特异性预防,一、人工主动免疫 概念：人工主动免疫是人为地将疫苗或类毒素接种于人体，使机体主动产生特异性免疫力的过程。是一种防治微生物感染的措施，主要用于预防。常用的人工自动免疫制剂有以下几种：,第二节 细菌性感染的特异性预防,（一）疫苗 1 死疫苗：用理化方法将免疫原性强的细菌杀死制成的。如百日咳、伤寒、霍乱、斑疹伤寒、流行性脑膜炎、钩端螺旋体病等 2 活疫苗：用减度或无毒的病原体制成,如BCG、鼠 疫和炭疽等的疫苗,第
6、二节 细菌性感染的特异性预防,活疫苗与死疫苗的比较 活疫苗 死疫苗 接种次数 1次 2-3次 接种量 小 较大 接种反应 轻 重 免疫效果 较好,维持1-5年 差,维持0.5-1年 毒力回升 有可能 不可能 安全性 有潜在危险性 安全性好 疫苗稳定性 相对不稳定 相对稳定 保存 不易保存 易保存,第二节 细菌性感染的特异性预防,3 基因工程疫苗 将编码有效抗原组分的目的基因插入适当载体,形成重组DNA,再导入宿主细胞,目的基因随重组DNA复制而复制,随宿主细胞分裂而扩增,使目的基因表达大量有效抗原成分,由此制备的疫苗称为基因工程疫苗 如把HBsAg基因插入酵母细胞中，成功表达并制备HBsAg疫
7、苗,第二节 细菌性感染的特异性预防,4 亚单位疫苗 利用带有细菌保护性免疫原的组分制成的疫苗如肺炎链球菌荚膜多糖疫苗、钩端螺旋体外膜蛋白疫苗等。此种疫苗免疫原性弱，需加佐剂或与类毒素结合成偶联疫苗，以加强免疫原性 5 重组载体疫苗将编码某一蛋白抗原的基因转入减毒的病毒或细菌而制成的疫苗活疫苗的特殊形式：痘苗病毒,6 核酸疫苗 或称DNA疫苗、基因疫苗 是将能编码引起保护性免疫应答的病原体免疫原基因片段和质粒载体直接注射入宿主体以表达目的免疫原，进而产生特异性体液免疫和细胞免疫的新型疫苗,第二节 细菌性感染的特异性预防,第二节 细菌性感染的特异性预防,（二）类毒素（toxoid）类毒素是外毒素经
8、0.3-0.4%甲醛处理后，失去毒性仍保持抗原性的生物制品加入适量的磷酸铝或氢氧化铝等制成精制的类毒素在体内吸收缓慢免疫效果好 如白喉类毒素、破伤风类毒素等,二、人工被动免疫 人工被动免疫：输入含有特异性抗体免疫血清或制备好的免疫细胞，使机体立即获得免疫力的过程，称人工被动免疫可用于某些急性传染病的应急预防和治疗，但维持时间短。常用的人工被动免疫制剂有：1 抗毒素 2 抗菌血清 3 胎盘丙种球蛋白和血清丙种球蛋白 4 其他免疫制剂（IFN-a,IFN-g,IL,CSF,LAK细胞）,第二节 细菌性感染的特异性预防,第二节 细菌性感染的特异性预防,人工自动免疫和人工被动免疫的比较 区别要点 人工
9、主动免疫 人工被动免疫 免疫物质 抗原 抗体或细胞因子 接种次数 1-3次 1次 免疫出现时间 慢 2-4周 快 立即 免疫持续时间 长 数月-数年 短 2-3周 主要用途 预防 治疗或紧急预防,三 生物制剂的使用及注意事项（一）接种对象：根据发病的年龄、职业、流行地区确立接种对象（二）接种途径：死疫苗、类毒素接种量大，常用皮下注射；活疫苗接种量小，常用皮肤划痕、皮内注射、口服及喷雾等；丙种球蛋白、动物血清和抗毒素采用肌肉注射,第二节 细菌性感染的特异性预防,（三）接种剂量、次数及间隔时间 死疫苗接种剂量大，常分2-3次注射，间隔时间随免疫力建立情况而定，伤寒疫苗产生免疫力快，间隔7-10天，
10、类毒素吸收较慢，间隔3-4周。一般需1-2年后再接种一次（四）接种反应及预防接种禁忌症 1.一般反应 2.异常反应 3.应用生物制品的禁忌症,第二节 细菌性感染的特异性预防,第三节 细菌感染的治疗,一、抗菌药物的种类二、抗菌药物的主要作用机制,1.试述检测病原菌的基本程序和原则？2.对已经分离出的细菌菌落，怎样从微生物学角度去进一步鉴定？3.试述疫苗研制及其发展的主要阶段？,思考题,第二节 病毒学诊断,标本的采取与运送,应注意下列原则,对本身带有杂菌(如咽拭子、粪便)或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。血清学诊断标本的采取应
11、在发病初期和病后23w内各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,在确定病原上是“黄金标准”!,动物接种,鸡胚接种,细胞培养,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,动物接种,是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜 神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内；痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,鸡胚接种,鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：,羊膜腔 尿囊腔 绒毛尿囊膜 卵黄囊等,第二节 病毒学诊断
12、,病毒的分离与鉴定,鸡胚接种,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,鸡胚接种,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,原代细胞：原胚肾细胞 二倍体细胞：人胚肺WI-26株细胞 传代细胞：癌细胞,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,病毒在细胞中增殖的指标：细胞病变效应-cytopathic effect,CPE 红细胞吸附现象-hemadsorption，HAd 干扰现象-interference,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,细胞病变效应-cytopathic effect,CPE,有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应(CPE)。常
13、见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。,有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,细胞病变效应-cytopathic effect,CPE,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,细胞病变效应-cytopathic effect,CPE,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,红细胞吸附现象-hemadsorption,HAd,流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素，具有
14、吸附脊椎动物(豚鼠、鸡、猴等)红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附；常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖；若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。,第二节 病毒学诊断,病毒的分离与鉴定,细胞培养,干扰现象-interference,某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如HAd)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清学诊断,原列情况需要进行血清学检查：,采集标本中分离病毒已很困难；目前尚未建立分离该
15、病毒的方法和技术；判断临床治疗效果；进行流行病学调查；基层医疗机构无法开展病毒分离实验。,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清学诊断,原理：是用已知病毒抗原来检测病人血清中有无相应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。,另外，在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清学诊断,中和试验(neutralizing test,NT test),补体结合试验(complement fixation test,CF test),血凝抑制试验(hema
16、gglutinatia inhibition test,HI test),凝胶免疫扩散试验,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清学诊断,中和试验(neutralizing test,NT test),是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。中和抗体(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。中和试验适用于病毒疫苗研究和人群免疫情况调查，在临床诊断上较少使用。,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清
17、学诊断,补体结合试验(complement fixation test,CF test),用已知病毒可溶性补体抗原(CF)来检测病人血清中相应(CF)抗体。CF抗原是病毒的内部抗原，同种异型间常有交叉，故特异性较中和试验低。但CF抗体（IgM）出现较早，消失较快，故CF阳性可作为近期感染的指标。,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清学诊断,血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test,HI test),具有HA的病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。这种现象能被相应抗体抑制，称HI试验。其原理是相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。本试
18、验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。,第二节 病毒学诊断,病毒感染的血清学诊断,血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test,HI test),病毒+鸡RBC=凝集（血凝试验）病毒+特异性抗体+鸡RBC=不凝集（血凝抑制试验）,第二节 病毒学诊断,病毒感染的快速诊断,形态学检查,第二节 病毒学诊断,病毒感染的快速诊断,病毒蛋白抗原检查,第二节 病毒学诊断,病毒感染的快速诊断,特异性IgM抗体检测,第二节 病毒学诊断,病毒感染的快速诊断,检测病毒核酸,核酸杂交技术,斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等,核酸扩增技术,PCR RT-PCR,第二节 病毒学诊断,病毒感染的快速诊断,检测病毒核酸,基因芯片技术,将已知的生物分子探针/基因探针，大规模或有序列排布在硅片等载体上，与样本中的相应生物分子/基因进行特异性的结合，在激光激发下产生荧光谱信号 荧光收集器收集荧光信号，计算机分析处理数据并报告结果。,
