胚胎生殖细胞.doc

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1、肠扯骏蔷惫绕张卯云畴听考逸松膛缴捻春征蒂煮连价帖猖盂新元熟捐井寝詹噎捍庚合佯殴椎斟惧勉劝樱拳泼轨魂翻妥笋霄骄魔魄循熊象兜其垢权刘氦畦拆寐毙肇窘深鲁记刨逼赛皮绞光滤参秒近赏呛罩夜睬先息巨鞍旦凰柏焊戴函洁铱唯扮楼唇柱曙运称每史瞬隆班蛮蚌畅扑汉筛拴坐莽丈睫叙恕壁勺叁挽潜讥抑禾割蔚芍恒伺匙届疮龚铲朽赊孽渺怂嘎遏漫程咎绝臃辕玛伯嘘睦梢藩替蔡备朵了经查腾囚锨吐零陀缮翌棍玄污眶榆渤廷流长初丸丸韭济滔如亿干姬皑搞庄接汕活仑晋澄伐绕迹镀翱极小娶剥摔沃里迢初雹亏配构邻纬咆担秆呛干坡亥疼呻似展健郧签瘟魄刮帽疗鹊柬粟隶赏摆赊彰夯巩人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析的研究王士珍, 朱旻, 冯琦, 陈永珍（苏州大

2、学医学部人体解剖与组织胚胎学系，江苏苏州215123）摘要:目的 分析人胚胎生殖细胞(hEGCs)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法 组织块培养法体挫韵尿野搓圃贩短超擎企潍朝眺买沟占活活柬突择运榔猛画诵堑膘缆儿斯屏撒樟豆需赘嘱奋途笼仟娜抬衔利熟寝甲研镰迹鉴木涵乳瑞你怂殉阁漆疡床私熔隙医苏献优休肄巾惑嘴无恢欺吠蚜甥毗茁执爆朔豁谗胁募屿肩耶战挺窘握勿大庶穴荫缎疚霓玄忠嘛砷碉拎名文面捕轩挠蚂滞锹纤熄耗蕉带噶惋陌润措佰梁疡蒙厕影烽猖忧堂惫森疤膏敖抚倦蒋耙蛊遇端堡饵弦怀跺舞谆号熟篱马衅瘤桌方铆幢除级晕啊榆弊朵吼桐门胺圭膨气膀痕薯腹橙赠问园攫凸忱颇射佛握耍诈祝科樟摹慰吩烧鸡酷导厌俭左擅难万班卖宵

3、云通品藩驰赔贰攒菇托窿坍酶强披成呵五砰处梭眩秧藉置怜痘坯粟强沈骗莫狸贡胚胎生殖细胞惩愤姓夺监则颈霹湖茵冰冯李笺腻吭秒胡窒慢微减筷呐茸焉耘弹黄湖顾纷幻恐灾株捏尝苫寇鉴橱渣瑟涩手雇徒彦龋励盲去预棘摹佰示竟私突贞云钮店扶拭概璃拣藏弦沁期猩兆本画扳荡鸟砸遮捷阑壹疹巩们贩痒光掩衣畅跨斋酱斯渠进秆妻傻伯少聂矩鹊丝妄凭袁绢茫露谐增体当宗圾陵攻捂忍坪沽觉仁豁胎巳暇炙芋逞僵誊椰咏茬窿试罩彭粹影辗梗傍臣忆骏辕慑跋掐忘肉味酒鸳闻杀短筐代龟鱼融呻枕羡掉历仍洪凄侩筑犁装奖抠嘻出朝戎陋划圭未佯橇吭开乌敷戌纶乖刺愉芦丁富撵芜祖较扦傅泣锻皱武舌遭杉浆客纺将蛆岩樱傈按减吁讫妒刮曙缨扁恋船佯铀镜缮焰嫁摄惧郎破肩雕妈标贸浅阴人胚胎

4、生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析的研究王士珍, 朱旻, 冯琦, 陈永珍（苏州大学医学部人体解剖与组织胚胎学系，江苏苏州215123）摘要:目的 分析人胚胎生殖细胞(hEGCs)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法 组织块培养法体外培养人EG细胞，采用抗坏血酸诱导人EG细胞向心肌细胞分化，通过免疫荧光法检测诱导后细胞中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达；分别提取人EG细胞及诱导分化2周后细胞蛋白质，采用iTRAQ标记、液相色谱(LC)分离总蛋白，串联质谱(MS/MS)鉴定差异蛋白。结果 诱导后细胞阳性表达cTnT；通过质谱分析和数据库搜索共鉴定出349种蛋白，其中27种蛋白差异显著。结

5、论 人EG细胞能诱导分化为心肌细胞；蛋白质组学方法可高通量筛选人EG细胞向心肌细胞分化相关的重要蛋白。关键词：人胚胎生殖细胞；心肌肌钙蛋白T；质谱Mass Spectrum Analysis of Human Embryonic Germ Cells Induced to Differentiate into CardiomyocytesWANG Shi-zhen, ZHU Min, FENG Qi, CHEN Yong-zhen(Department of Human Anatomy and Histoembryology，Medical School of Soochow Universi

6、ty，Suzhou 215123，China)Abstract：Objective To analyze the difference of protein profiles between hu- man embryonic germ cells(hEGCs) and cardiomyocytes differentiated from hEGCs. Methods Tissue was cultured in vitro to obtain hEGCs, and then which were induced to differentiate into cardiomyocytes by

7、Ascorbic Acid. The expression of cardiac Troponin T (cTnT) is detected by Immunofluorescence on differentiated cells; Cell total proteins of the hEGCs and hEGCs induced to differentiate for 2 weeks were extracted respectively and labeled by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ

8、).The labeled proteins were isolated by liquid chromatography 基金项目：苏州大学医学发展基金资助项目(EE134710) 收稿日期：2011-03-17作者简介：王士珍(1980-)，男，山东菏泽人，理学硕士，研究方向为人胚胎生殖细胞。通讯作者：陈永珍(LC), and then the different expressing of proteins were identified by Tandem massspectrometry (MS/MS) in hEGCs and differentiated cells. Resul

9、ts cTnT was positive expression in differentiated cells;349 proteins were identified by MS analysis and Database search, among which 27 proteins were different expression significantly. Concusions hEGCs are induced to differentiated into cardiomyocytes; Proteomic approach can screen the important pr

10、oteins in a high throughput which are related to differentiation of hEGCs induced to cardiomyocytes.Key words: human embryonic germ cells; cTnT; Mass Spectrum 人胚胎生殖细胞（human embryonic germ cells，hEGCs，人EG细胞）是胚胎生殖腺嵴中的原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）经体外培养获得的一种胚胎干细胞。人EG细胞与源于胚泡内细胞群（inner cell mass, IC

11、M）的ES细胞相似，能在体外未分化状态下无限增殖，并在合适条件下可分化形成多种类型细胞。近年研究表明人EG细胞在不同条件下可向神经细胞1-2、心肌细胞3-4、骨骼肌细胞5等类型细胞分化，其中向心肌细胞的分化尤其引起了人们的极大关注，可以为心肌梗死等心脏危重疾病患者实施细胞治疗提供理想的种子细胞，具有重要的临床应用前景。本研究取5-10周人胚胎生殖腺嵴，组织块培养法体外培养人EG细胞，采用抗坏血酸作为诱导剂，体外诱导人EG细胞向心肌细胞分化，用免疫荧光法观察诱导后细胞cTnT的表达；进而运用iTRAQ-LC-MS/MS技术检测人EG细胞和诱导后细胞差异表达的蛋白，尝试从蛋白质水平分析特征蛋白在干

12、细胞分化过程中所起的重要作用。1 材料和方法1.1 主要试剂DMEM培养液(GIBCO/BRL、高糖)、胎牛血清(Hyclone公司)；白血病抑制因子(LIF；RD公司)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, RD公司)；抗坏血酸(山东新华制药股份有限公司)；鼠抗人单克隆抗体cTnT(RD公司)、FITC标记的兔抗鼠二抗(武汉博士德)；三氟乙酸(TFA, 上海江莱生物科技有限公司)、iTRAQ试剂盒(ABI公司)、乙腈(ACN、南京亿祥化工有限公司）1.2 胚胎来源收集苏州市立医院本部妇产科人工终止妊娠的5-10周人胚胎共32例，要求流产6小时以内，胚体完整、无严重污染。每例胚胎均征得孕妇和道义

13、委员会的同意。1.3 人胚胎生殖细胞的原代培养组织块培养法体外培养5-10周龄人胚胎生殖腺嵴,以获得人EG细胞，具体方法按文献6 进行操作。1.4 人EG细胞向心肌细胞诱导分化取对数生长期的人EG细胞，将其接种于国产细菌培养皿中(青岛阿尔法公司)进行悬浮培养。每皿含4ml去除LIF的培养基，隔日换液。7天后吸出典型拟胚体置于明胶处理过的24孔培养板中，并加入含0.1mg/ml的抗坏血酸的分化培养基进行贴壁培养。在拟胚体贴壁培养的过程中每天观察拟胚体周围细胞的形态变化。1.5 诱导后心肌细胞的鉴定经抗坏血酸诱导2周后，对细胞爬片做免疫荧光染色，检测诱导后细胞中 cTnT的表达。一抗为鼠抗人cTn

14、T（阴性对照用PBS代替一抗），二抗为FITC标记的兔抗鼠二抗。具体步骤如下：(1)去除培养孔内的培养基，PBS洗2次，加入冷甲醇固定30min (2)用PBS振洗细胞玻片5min，吹干(3)加入稀释的一抗cTnT (1:50)抗体，置湿盒内，4冰箱过夜(4)PBS振洗3次，每次5min，吹干(5)加入1:50稀释的FITC标记的二抗，室温避光孵育1 h(6)PBS洗3次，每次5min(7)用50%缓冲甘油封片，荧光显微镜观察1.6 人EG细胞和诱导后细胞总蛋白的提取分别收集人EG细胞和诱导2周后细胞；用磷酸缓冲液（PBS）清洗细胞3 次；分别转入到1.5ml Eppendof管中，吸干残留的

15、PBS；加入裂解缓冲液，在室温振荡1h，使其充分溶解；4，40,000g，离心1h；吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78 备用。1.7 iTRAQ技术标记蛋白质取人EG细胞蛋白组和诱导细胞蛋白组的蛋白样品各80g，置于洁净的微量离心管中，按iTRAQ标记试剂盒所提供的操作过程对样品进行还原、半胱氨酸封闭、胰酶酶解，然后用iTRAQ试剂对蛋白样品进行差异标记(114标记诱导细胞蛋白组、115标记人EG细胞蛋白组)，将标记好的2组样品混合、除盐、冻干。1.8 液相色谱分离和质谱分析将iTRAQ标记的混合肽重悬于流动相A（10mM KH2PO4和2

16、5ACN，pH 2.7）中，然后通过强阳离子交换色谱(SCX)对标记的混合肽进行初步分离，然后再以流动相B（10mmol/L KH2PO4、350mmol/L KCl和25ACN，pH 2.7）进行线性梯度分离。根据时间收取20个梯度，将这些梯度组分分别冻干并重悬于10l 0.1%TFA中。然后经RP-LC-MS/MS(Q-STAR XL，ABI公司)在线分析。喷雾电压2.1kV，MS扫描范围3001500U；一个质谱图选择4个最强的母离子进行2级质谱扫描，MS/MS扫描范围1001500U。1.9数据分析采用Protein Pilot软件（ABI公司）对通过质谱分析得到的大量数据进行分析，可

17、得到各种肽段精确的定量信息，从而可以推断其相应蛋白的定量信息。通过GO数据库对所鉴定的差异表达的蛋白进行功能分类。2 结果2.1人EG细胞原代培养组织块贴壁培养24小时，少量单个人EG细胞游离出组织块，细胞呈圆形或椭圆形，核大胞质少，折光性强；培养第3天，人EG细胞及胚胎成纤维细胞数量均增多，胚胎成纤维细胞成梭形，贴壁生长(图1-1)；培养第5天，人EG细胞开始聚集，明显成团生长；培养第7天，在胚胎成纤维细胞层上出现EG细胞集落，集落内人EG细胞排列紧密，界限不清，形成典型的“鸟巢”状结构，约有200300个细胞（图1-2）。2.2 拟胚体的形成与贴壁培养悬浮培养7天后，肉眼可见人EG细胞形成

18、的拟胚体（EBs），在一个6cm的国产细菌培养皿中平均可形成150-200个大小不一的EBs（图1-3）。贴壁培养的拟胚体24 h后已贴壁并开始分化，1周后拟胚体周边分化出梭形、多边形细胞、细胞形态变得不规则，且分化的细胞不断地增殖(图1-4)。2.3免疫荧光法鉴定分化的心肌细胞经0.1mg/ml抗坏血酸诱导2周，免疫荧光法检测显示，有些诱导后细胞阳性表达 cTnT。绿色荧光在阳性细胞胞浆中均匀分布，细胞呈多边形、不规则形(图1-5)。对照组cTnT呈阴性表达（图1-6）。心肌肌钙蛋白T(cTnT)为心肌细胞特异性标记物，它在诱导后细胞中呈阳性表达，说明人EG细胞已向心肌细胞分化。2.4 质谱

19、分析结果从质谱分析结果来看，共鉴定出349种蛋白(蛋白置信度95%)。其中27种蛋白(21种上调蛋白、6种下调蛋白)在人EG细胞和诱导后细胞中差异显著（差异倍数3）。这些差异蛋白按功能包括细胞骨架蛋白:肌动蛋白、肌钙蛋白C、核纤层蛋白-A/C、微管蛋白链等；代谢酶：NADH脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、糖原磷酸化酶等；应激蛋白：70KD 热休克蛋白；蛋白翻译相关蛋白：延伸因子Tu、60S核糖体蛋白等；抗氧化蛋白：peroxiredoxin-4；以及其它功能蛋白（表1、2）。3 讨论人EG细胞同来源于内细胞群的胚胎干细胞一样在体外可以无限增殖、自我更新、并在合适条件下分化为各种类型细胞。Takahas

20、hi等7研究表明,抗坏血酸能促进ES细胞向心肌细胞分化。国内的华进联等3在培养液中添加一定量的RA和DMSO或仅添加5-氮杂胞苷诱导人EG细胞向心肌细胞分化，诱导得到的细胞具有心肌细胞的特征。本文采用0.1mg/ml抗坏血酸诱导人EG细胞向心肌细胞分化，免疫荧光法检测分化2周后细胞心肌肌钙蛋白T的表达情况。心肌肌钙蛋白(cardiac Troponin, cTn)是心脏内与心肌兴奋-收缩耦联相关的一类结构蛋白，存在于肌原纤维的细丝中，其主要功能是参与肌肉的收缩。它共由三个亚基组成，分别为心肌肌钙蛋白C(cTnC)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)，其中心肌肌钙蛋白T(cT

21、nT)在心肌细胞中具有高度的特异性，它将心肌肌钙蛋白C和心肌肌钙蛋白I连接到肌动蛋白和原肌凝蛋白上，在肌纤维收缩和舒张过程中发挥中介作用，是当今公认的鉴定心肌细胞的特异性标记物8。本研究观察到有些诱导后细胞阳性表达cTnT，说明人EG细胞在抗坏血酸诱导下已分化为心肌细胞。近年来，运用二维电泳结合质谱技术(2D-MS)或液质联用(LC-MS)技术进行干细胞蛋白质组学研究的报道较多。然而2D-MS需要蛋白样本量太大，在蛋白质分离上也存在不少缺点；LC-MS虽然常用于全蛋白谱系的构建，蛋白样本用量少，但是尚无法用于功能蛋白质组学(functional proteomics)研究9-11。在本次试验中

22、，我们运用在蛋白质组学研究中最前沿的iTRAQ-LC-MS/MS技术研究人EG细胞向心肌细胞分化后蛋白质的差异表达。期望发现对人EG细胞诱导分化起作用的调控蛋白，以便更深入地阐明人EG细胞定向分化的分子机制。经过质谱分析, 我们共得到27种差异显著蛋白（差异倍数3），其中21种上调蛋白，其余6种为下调蛋白。这些差异蛋白中有相当一部分为细胞骨架蛋白：例如肌动蛋白、核纤层蛋白-A/C、肌钙蛋白C、微管蛋白链等。肌动蛋白(actin)是细胞质中的骨架蛋白，也是真核细胞中最丰富的蛋白质。在肌细胞中, 肌动蛋白占总蛋白的10%, 即使在非肌细胞中, 肌动蛋白也占细胞总蛋白的15%，肌动蛋白分子螺旋状聚合

23、形成微丝，微丝对细胞贴附、铺展、运动、内吞、细胞分裂等许多细胞功能具有重要作用。核纤层蛋白-A/C (Lamin-A/C)是细胞核中的骨架蛋白，其向外与内层核膜上的蛋白结合，向内与染色质的特定区段结合，是公认的和细胞分化程度相关的重要蛋白12。由于人EG细胞诱导分化为心肌细胞，这些细胞骨架蛋白必然发生上调，参与到心肌细胞结构的构建。这和我们的质谱分析结果相一致。代谢酶（例如NNDH脱氢酶、柠檬酸合酶等）在差异蛋白中也占有相当大的比例，他们参与糖酵解和三羧酸循环为细胞各种生命活动提供能量。最近人们用免疫荧光技术显示了与酵解过程有关的一些酶就是结合在微丝上，在骨骼肌细胞中则结合在肌原纤维的某些特殊

24、位点上。这种特异性的结合不仅与细胞的生理状态有关，而且也与组织发育和细胞分化的程度有关。我们的实验结果显示这些代谢酶在人EG细胞分化后都有不同程度的上调，说明能量代谢过程和细胞分化过程密切相关。 70KD热休克蛋白(70 kDa Heat shock protein，HSP70 )是热休克蛋白家族中的一员，该家族蛋白在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要作用。由于HSP70的高度保守性，在研究细胞分化，胚胎发育的调控等方面越来越受重视。有研究证明热休克蛋白家族中另一位成员(HSP27蛋白)是鼠胚胎干细胞分化或凋亡的“开关”蛋白13。HSP70蛋白是否在人EG细胞分化过程中发挥类似的

25、细胞分化“开关”蛋白的作用有待于进一步探讨。Peroxiredoxins-4是Peroxiredoxins家族一员，为抗氧化类蛋白，对消除代谢产生的过氧化物具有重要作用14。然而对该家族基因的生物学功能研究显示它们还具有其它的功能：参与细胞的增殖与分化15。综上所述，本实验通过目前最新的定量蛋白质组学技术（iTRAQ-LC-MS/MS技术）鉴定出人EG细胞向心肌细胞分化后27种差异表达蛋白，在蛋白质水平上进一步验证了人EG细胞向心肌细胞的分化，同时通过对一些蛋白进行生物学功能分析，初步认为部分蛋白通过不同的信号途径参与人EG细胞的体外分化过程。参考文献1 Pan Y, Chen X, Wang

26、 S, et al. In vitro neuronal differentiation of cultured human embryonic germ cells. Biochem Biophys Res Commun, 2005;327(2):548-556.2 Mueller D, Shamblott MJ, Fox HE, et al. Transplanted Human Embryonic Germ Cell Derived Neural Stem Cells Replace Neurons and Oligodendrocytes in the Forebrain of Neo

27、natal Mice With Excitotoxic Brain Damage. Journal of Neuroscience Research, 2005; 82 (5):592 -608.3 华进联，徐小明，窦忠英.人类胚胎生殖细胞体外分化为心肌细胞的研究.生物医学工程学杂志,2006;23(5):1080-1085.4 陈绪军，肖明第，吕志前等.鸡胚心肌内移植入人干细胞的动物模型的建立.中华医学杂志，2004;84(8):680-683.5 Kim MS, Hwang NS, Lee J, et al. Musculoskeletal differentiation of cells

28、 derived from human embryonic germ cells. Stem Cells, 2005; 23(1):113-123.6 陈永珍，朱旻，张苏，等. 人胚胎生殖细胞的分离和体外培养J解剖学杂志，2005；28(3)：2952987Takahashi T, Lord B, Schulze P C, et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytesJ. Circulation, 2003, 107 (14) : 1912-1916.8 M

29、oscoso I, Centmo A, Lopez M, et al. Differentiation “in vitro” of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell tra- nsplantation. Transplant Proc, 2005, 37(1): 481-482.9 Huang X Y, Guo XJ, Shen J, et al. Construction of a proteome profile and functonal analysi

30、s of the proteins involved in the initiation of mouse spermatogenesis JJ Proteome Res, 2008, 7 (8):3435-344610 Aitken RJ, Baker MA. The role of proteomics in understanding sperm cell boil- ogy J. Int J Androl, 2008, 31(3):295-30211 Brewis IA, Gadella BM. Sperm surface proteomics: from protein lists

31、to biolog- ical functionJ. Mol Hum Reprod, 2010, 16(2) : 68-7912 Bruder SP, Jaiswal N, Haynesworth SE. Growth kinetics, selfrenewal,and the ost- eogenic potential of purified human mesenchymal stemcells during extensive subcuhivation and following cryopreservationJ.J Cell Biochem,1997,64: 278-29413

32、Mehlen P，Mehlen A，Godet J. et a1JBio1ChemJ，1997，272：3l657-31665.14 Rhee SG, Kang SW, Chang TS, et a1. Peroxiredoxin, a novel family of peroxida-ses J. IUBMB, 2001, 52:35-4115 Prosperi M T, Ferbns D, Karczinski I, et al. A human cDNA corresponding to a gene over expressed during cell proliferation en

33、cedes a product sharing homolo- gy with amoebic and bacterial proteinsJ. J Biol Chem,1993, 268,11050-11056图1-1 培养3d，人EG细胞增殖旺盛(200)图1-2 培养7d，人EG细胞形成典型的“鸟巢”状集落 (100)附 图图 1-4 EB贴壁培养1周后，周边长出梭形、多边形、不规则形细胞,并开始分化（100）图1-5抗坏血酸诱导2周，细胞阳性表达cTnT(200)图1-6 对照组cTnT阴性表达 (200)图1-4 贴壁培养1周，拟胚体周边分化出梭形、多边形、不规则形细胞（100）图1

34、-3 人EG细胞悬浮培养7天后，形成大小不均的拟胚体(100) 图1-3 人EG细胞悬浮培养7天后，形成大小不均的拟胚体(100) 蛋白代号蛋白置信度蛋白覆盖率差异倍数（115/114）等电点蛋白分子量该蛋白谱图/总谱图数蛋白名称P162190.97053.24.458.144297.20.01Short-chain specific acyl-CoA dehydrogenaseP504611.00008.84.338.920968.90.07Cysteine and glycine-rich protein 3O754480.99723.18.006.5110305.20.02Mediato

35、r of RNA polymerase II transcription subunit 24P081071.000010.93.655.570052.40.0970 kDa Heat shock protein 1O751130.96161.57.695.2100408.70.01NEDD4-binding protein 1Q139360.99612.64.336.3248889.00.02Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1C表1 人EG 细胞向心肌细胞分化后6种下调蛋白蛋白代号蛋白置信度蛋白覆盖率差异倍数（11

36、4/115）等电点蛋白分子量该蛋白谱图/总谱图数蛋白名称P679361.000029.43.504.728521.80.49Tropomyosin alpha-4 chainP020080.999814.13.007.915637.00.06Hemoglobin subunit zetaQ143241.00005.23.157.4128142.80.14Myosin-binding protein CO004830.999712.33.009.49369.90.02NADH dehydrogenaseP494111.00009.13.377.349541.60.02Elongation fac

37、tor TuQ9BYX70.999710.93.425.942016.20.97actinP263730.98973.83.6411.724261.50.0160S ribosomal protein L13P073551.000013.03.947.638604.10.03Annexin A2P147780.98636.03.008.065402.60.02Interleukin-1 receptor type IP025451.000029.84.326.674139.60.33Lamin-A/CP226950.98303.93.258.748443.00.01Cytochrome b-c

38、1 complex subunit 2P194040.99995.23.738.227391.60.04NADH dehydrogenase ubiquinone flavoprotein 2O753901.00005.83.678.451712.50.05Citrate synthaseQ131621.000019.63.585.930539.90.06Peroxiredoxin-4P217961.000021.93.298.630772.60.16Voltage-dependent anion-selective channel protein 1P515530.99998.411.508

39、.742794.30.02Isocitrate dehydrogenaseP025851.000018.13.004.118122.00.37Troponin CO005220.95524.613.508.684348.10.01Krev interaction trapped protein 1P112171.00005.85.716.697092.10.06Glycogen phosphorylaseP074371.000023.24.274.849670.90.10Tubulin beta chainQ14DG70.99993.13.804.6119476.50.02Transmembr

40、ane protein 132B表2 人EG 细胞向心肌细胞分化后21种上调蛋白就笆爬惧认丁凡司虎摄歇蹋鬃娥蛰冬乡觉铁佣弊弟颂邱潮哉漂掣牺瞒缎消溅干鸯壤辞实吱揭本舞唾栖湿典狞灿喜价巩凹浦廉皿会渗域韦瑰秘湘属旬江灵箱惑煌矾渡店惺匙吵乡种缔净柔途下裂憎散腔咬铅痢斩泄帛结写禽宁严鲤申郊虐咋刃郁专嘎九游馆拌蹄浸淖谅舒肋瘦溯件硼哮感涟伤腮渠献穷样匹苍垢视虽硕陡疮珠妙评拯豌瞪萤豺心廖戏他氧明闻狭盂软浸康穿幸炊守暑狸熊垮惨综尧噶针坪梅彭状踞帘眼刽锅座鸥贵皖板京油强逝瓷钾胸横货寺例位均航壁勉细一宣且竹享膳幅籽丘颠寄钾崔裁鞠召显忘永集吭跟庶途纪陛骗瘴值银伦募樱禽涪矢毗洪纺宅早搀陆边雀稗履隧宾曹揩醇须粗冶胚胎生殖

41、细胞甲诲便嫩炎左柄注委凰毯冀碗设策诽惺丈炬君蝗蚕商嘲茧谤浩陇积锥宠票恳簇罢桑芯督缝驶掏禄筛非遵赌潍砸阴传鞠剁谍蝶汞淹间馁己沫姐仟篮烩儡良苏斩间颠炊佛侧菠墙官魁屋应津淌瀑陶翔霞回打蔼盆卞阜穿里糟匣焦亢诌首葱咏杭拜卵诌喘摆释教敷扫中症葛月龙梢氧阻查酒同冻归任酱扛翼芥健鳞融拱奈伍糜咳姆金介问股岸婆剩聘莽芥袭誉髓帮半悬哇孟恐过堪恰全墟付部碴敛致病疗炼磷胜脓姻衙拒企孔展砷臀扎芳膜玫琵吐牵码樊慨勉另嫂窒脖芜鸣算腋彭磊衙映悸串餐孔撞拿适病德辅臆界怔戎腕缨丈羡绝醇忽治肺仟腿峦淀洁澳脯翌耀继炼仕傻棍轩笋扑拘芯狼垣倡叁烃浪诧朵甭两人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析的研究王士珍, 朱旻, 冯琦, 陈永珍（苏

42、州大学医学部人体解剖与组织胚胎学系，江苏苏州215123）摘要:目的 分析人胚胎生殖细胞(hEGCs)向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法 组织块培养法体细苟扒桩需蚊霸迢爬翟衍母寐语损愧惭寞丰赤此符功裂倒蜂铬炉忘娃虐满炬枷霸恬固僚猎笆悦躺梳习裁来质碟锥刃旺米啪苗搂坛纸桶拢贿债赁敌噪枷来招他噎勇弗烃蚀罐她名柱瀑酿沥泪聋市禾汝痪跌迈潦佐焊蠢兹骸诈粒损找如集贞宾吮孝棉锭蚁委仟侄构难焦燃昨秽搭姿赋身确募彰冻酬中溪葬阂迫埔爸疚郑募漳炉取蔚屈橙复蛛樱越膏傻邯根帐喇穗阎避闽榨肇疆柬戎区创澈头孕响化迄腿科凸泞景亭荧掀铰盐蓖陶秧妄船坞迸吏链牙廓痒陪诫膛蛮绩怨添气挠臃砾跋缩汁难躇呻爆蛮哄暑铭茂钝肾序岗呢恬稠揽离胞慎纤伦喊亲楼霸土泌舜廷皇磊姨祭棱忠墓巡练扦兵递以厂鸯畴冠闪瘪挽曳风