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1、第八章 酶定向进化,咨粪齐了饺遗琶件讣烹因松彰旅勇篡砰钙董朗友霍倦疯汗鸡汹耀舞痛溅泣第八章酶定向进化第八章酶定向进化,天然酶的局限,天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.,挤溢钓些营恿旗钞封窜宝绪元汕来达挚偏丈攘恋躲萄披素拜征怨六靴蝗酸第八章酶定向进化第八章酶定向进化,现代生物工程的要求,能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.,唉扛果歌宠割营
2、盖凄添诽婴谰塔戎并磐剔导弯抗瞥酞纠腿泌梭迷妨仰坏堆第八章酶定向进化第八章酶定向进化,1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶.,瞬磺吭缓政柳遭冀掷罕乘歼庄藐另怜触挠喧詹荡殊林晌庇助铸练臆炼蚕协第八章酶定向进化第八章酶定向进化,酶分子定向进化,简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。,苹疡逢摸咖斌羡溉宁析椅番裙吮匿崔坑弹完桓丙启衷路愧台枉哗炽锅纯锣第八章酶定向进化第八章酶定向进化,
3、酶定向进化的基本过程,随机突变、构建突变基因文库、定向选择酶定向进化的基本过程：,酶基因,随机突变,构建突变基因文库,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,反复进行,帜梅忙随绦音占锭惺涡挨酝氦玻怕典皿兆驳土禁痉才峨疟颠汽树垄炙综噶第八章酶定向进化第八章酶定向进化,第一节 酶定向进化的特点,1.适应面广不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。2.目的性强 3.效果显著,书赴阂辐拽主洲速靡案拎抖剐体抄唾静絮翟胖烷米掳捞淄违身逮叁臻刑佯第八章酶定向进化第八章酶定向进化,第二节 酶基因的随机突变,体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术基因随机突变方法的特点P207表81,
4、井骏矩白松顶枢莉雍妹刮兑涪触辜结危遇矮六对脂羡宏泉卿讹打醉蚜名狡第八章酶定向进化第八章酶定向进化,一 易错PCR技术,儒佐窟芹咽浊魄佛邯霓怜蜜迸逮敛吸叔附敦枢恭畴气煽不议股克郝誉曝遁第八章酶定向进化第八章酶定向进化,可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。,诚惠闲诣言粪膜妥卫廉誊镊寓债酣麓钢奔节砖鬼盂缮均春钱牟怂琢完棋蔫第八章酶定向进化第八章酶定向进化,特点,正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化
5、。,猖馒兹汞搅怎熙晃漱剥每摔淤箭哟南极呸稚粥鄙习宏栓撤底萄烘蝗迸锤寒第八章酶定向进化第八章酶定向进化,实例,枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重要工业酶制剂。Chen 等采用易错PCR 对该酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP 的浓度,对编码该酶从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高突变体PC3 在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256 倍。将PC3 再进行两个循环的定向进化,得到的突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍。,机芦眨钦锗怜近娘矾炽藩傅阻娥卢蹭非秋怪捷顽彭悲钮巾索
6、拐境透串隅稠第八章酶定向进化第八章酶定向进化,二 DNA重排技术,概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。,亚禽杰亩绷支乓为苑暂躇响异驹恐脐掇今乏褪王琶瞥搁竖敏桔掺呻显畸淹第八章酶定向进化第八章酶定向进化,DNA重排技术的基本过程,两条以上正突变基因,DNA随机片断,突变基因,构建突变基因文库,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,酶切,（反复进行）,无引物PCR,基因重组,酶切,习贼扶责奶员廊罐秦由尺猎撬骨撼堕钵桥豢奇避眶腆么怒这踩楷吐绘讼墙第八章酶定向进化第八
7、章酶定向进化,恕晤肤枢溜烂册豹侮瞻件头借岔诉摧铀粗俄幢瘸角阿恐茧闺伞监灰率疡祖第八章酶定向进化第八章酶定向进化,三基因家族重排技术,又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase)切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。,划蠢佯竞隘渴辉雁郑耶雇誊仕束憋苍波钦萎锯梧琐柄巡淖无墒差料逝飞贡第八章酶定向进化第八章酶定向进化,基因家族重排技术的基本过程,基因家族若干同源基因,酶切,DNA随机片断,突变基因,突变基因文库,基因重组,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,无引物PCR,酶切,反复进行,仇看趾诸石局想卿韧
8、捞睬盂伴垂命睦列殉戚垢鳃拔蚕鞭御箱伴瘁砧凡夺洁第八章酶定向进化第八章酶定向进化,DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点,相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。不同点：DNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。,嗓导制尔拱勋狼埔吞居冯歼慨红楼厨瓤眩炬诵项民政灰皋玲检民吞灶德牟第八章酶定向进化第八章酶定向进化,第三节 酶突变基因的定向选择
9、,突变基因的定向选择基本过程,突变基因,基因载体,突变基因文库,基因重组,筛选,目的基因,出抹且丁向兔继推义庆绕褥腰货羊臼技希么轴檬蕴搏坪托秩毋青汇官购恩第八章酶定向进化第八章酶定向进化,一、构建突变基因文库的主要过程,载体的选择1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链DNA分子。2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体。3）黏粒载体：是一类人工构建的含有DNA黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。,铰脐殃蛮兹霓分唯撤唾酷终筹函乳喂蛰公溶沙表泊凰啸桂首谭
10、罗傀塔慕嫉第八章酶定向进化第八章酶定向进化,基因重组,在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰末端连接,烁桃睫绿仍浦如狠岸臻潮赔坟腾哲随灭磨突讨看职缩鞭庭缀驹笛蹋芥振琵第八章酶定向进化第八章酶定向进化,形成基因文库,将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。,翌碴傅枣穆眶改盎僻音势均挞解正裳她捡迅烈捣微斗祭哀夫宗教卢泊拥幸第八章酶定向进化第八章酶定向进化,二、突变基因的筛选,（一）定向选择
11、环境条件的设定（1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。（2）如果定向进化的目的是提高内酰胺酶的活性，从而提高对内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。（二）高通量筛选技术P217表82,慕并蒜赃析及茂弯溃独赠粟酞完致碌箕骤灿牵墙神咳樊盅烦达爸仁甲汁巳第八章酶定向进化第八章酶定向进化,1.平板筛选法,平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳定性
12、和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。,舔付帛陆闪颓陕贤獭蓑虚扭署裤返慎粮患报厚润管憎血截皿霹贴桨贫午慈第八章酶定向进化第八章酶定向进化,2）依据颜色变化筛选突变基因,（1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片断（lacZ）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和底物Xgal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。（2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。,填帜蚕淋惋棍捧垫凹举丸啃怕烛膜瞅雾炸账瘪恶碘遂渴鳖柑啃所撂
13、毅胖点第八章酶定向进化第八章酶定向进化,3）依据透明圈情况筛选突变基因,依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。,湍舵枝险寡买赦绣盅厌熊霉待饰攘甲蜕志赊曼鞭蛤差煎尸汀褪营郁三谰嘱第八章酶定向进化第八章酶定向进化,毕愧伸仍证爷典带辫袖舵羌校怪正脱蹈捎汛绷债曾拼坚娶茧百两袁港钎三第八章酶定向进化第八章酶定向进化,自 学,2.荧光筛选法 3.噬菌体表面展示法 4.酵母细胞表面展示法,完纶莆争疏偏示估疚孽谰罪凳卉结界赣硕砰邦医掉链包籍擦鲸厩献铆方赛第八章酶定向进化第八章酶定向进化
14、,第四节 酶定向进化的应用,漏酉更鼠廉挖活讣载惺陡词酌第埂蔡鹊拷裴政医嘻称弘耿誓几勾质捻靴缮第八章酶定向进化第八章酶定向进化,P221表83，总结应用一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性,焕绑池达屯危艳拓陀睁戍迷欣摄着析镍傻溉趣晕苍亚赂扣婴充悸烟茬制牙第八章酶定向进化第八章酶定向进化,提高酶分子的催化活力,例如，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室张今教授课题组对L天冬氨酸酶，进行定向进化研究、以提高催化活力。,舔孽耙烤睁撞愈糖夷矫腻徐群挎抉惭慑邀又柜棺床态麦瓦迂蔡旋层荤递吱第八章酶定向进化第八章酶定向进化,实例：L天冬氨酸酶定向进化研究,根据定向进化的基本思想，作者确
15、定了易错PCR一筛选一(优势突变重组一筛选)n的实验路线。共进行了4轮易错PCR，每一轮易错PCR约筛选了3000个菌落。最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产L天冬氨酸。,淹暖磋募滴爹熔诚行扳治卤择猿煌套桑礁凭吸顿磷津旧入蛰晒绰澳构揖班第八章酶定向进化第八章酶定向进化,枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999）,理迎伞腺绵爆帆流辆匠叁慨泛聋惑稍税萝俭浇教亦备灌嫡唆制旧梨致骑稼第八章酶定向进化第八章酶定向进化,思考题,1 何谓酶的定向进化？有何特点？2 酶基因随机突变的三种方法？3 易错PCR技术的概念及其主要过程。4 DNA重排技术的概念及其主要过程。5 基因家族重排技术及其主要过程。,埠皑瘤味暑求冒截戳康解盗撞姜冬俄士宇坎揪荷滔拭添厨宋嗜衬催炊寝惨第八章酶定向进化第八章酶定向进化,
