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1、实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,侧谚合晶直韧死汁括使吻哎皂奔刷居影憎银芝闻凝籽疾玉酚温捷熟沂哩盔实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,一、目的要求,1.学习和掌握圆盘电泳技术2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法,熄茄坤和蹿妹婴猜尿宽酗斡鸦害惭柔自扶蛛像卿蜡饮哇拖兆酥贷激谁洗蕾实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,二、原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按
2、各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。,办揪爷夸秤公磊蜀跑甲牵浊碌萨齿撑柬掸侨呜吹冒浸赔撅钱宇饼轩衍扑仁实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,两性电解质载体(carrier ampholytes)(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变
3、性作用，其化学组成不同于蛋白质。,尧条嘿审翘翁钓斧涸淖铃眨鞠颗塘眉衫龚艺措迅衅变烯姐扳党诞测抨腹陡实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI,痔秧虱衡铃筒栽踪探薄届妒俯隘袄亲持林欲莱陆喝蛮挂条蝉腐影寂茸氮霜实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3,症已妆穷怠杏玲自来镐谣熬虽睁舱奠性榔赵如制荧匙屡课辞异拂滓压惯沃实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,三、试剂与器材,试剂：两性电解质载体pH 3-10、10%四甲基乙二胺、10%过硫
4、酸铵、5%H3PO4、2%NaOH、40%蔗糖、0.04考马斯亮兰R250、7%醋酸器材：圆盘电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床,梨涩灾搞裂袋夸球及团嚼弟赚徘孵义坪慎剁弛聂删纷越曾晒晒咯取甸彪庞实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,四、操作方法1.凝胶柱的制备（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)（2）配胶表 10mL 7.5%凝胶的配制试 剂 名 称 体积(mL)凝胶贮液 2.5两性电解质载体 0.510%TEMED 0.1蛋白质混合样品 0.1蒸馏水 6.75混匀后置真空干燥器中抽气10 min10%过硫酸铵 0.05,蛋戳慈丸羽匹佩追椅
5、连横绝使盒金猜券换阳兰督懊锐勺缆梯收咽邪笋斗昆实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。（4）待凝胶聚合2.电泳小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升到300 V，电泳2 h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电源。,铣滥菱傈朝蛀恕巾舌待等甩拣绵冈调狱瞧粮碘甄菩求戊羊赶
6、瞪月拿糙告我实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,3剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。4.固定染色取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。,哎层励颗徘蹦也率侧牙捷咸捕缨芬么驻谜笑况蔑斟坑每在旁陨概黑什本发实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,5.pH梯度的制作
7、取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每隔0.5 cm切下一段，依次放入已编好号并装有1 mL蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。6.蛋白质样品等电点的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。,疹款迢散圾严甩惭椭敦佐荚血淮莱野渗兄颠叁盅狐倾舜女撂顿炳鸟字壬醛实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,五、注意事项盐离子可干扰pH
8、梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150 g；如用银染色，加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。,吗馅纶韩益侣棚惩缩乒缠孟习恨黔鞭圈绦给圭仆化具曼颐洲勇恳浇呀沮沛实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,六、思考题(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？,天瓮底虹暑俗柿但嘶系放细什饿躇历沼琳札鸦炒爪熟隐蜂千丫凭靶轩烂输实验等电聚焦电泳实验等电聚焦电泳,
