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1、发酵工程第三讲内容,第六章、种子的制备过程 1、概述1.1 种子的扩大培养的目的 种子的扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种经试管斜面活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐扩大培养而获得一定数量活力旺盛的纯种过程。,哎载汞森房邯厩貌凑蜒苔穆芯俊筛诌窍纳歼把放活响琢常贱函冰恼削诬涅2010本科生第3讲2010本科生第3讲,1.2 优良种子必须具备的基本条件 种子的优劣对发酵生产起关键作用。因此必须制备优良种子。1.2.1 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短 1.2.2 生理性状稳定，生长过程稳定 1.2.3 无杂菌污染，确保整个发酵过程正常进行 1.2
2、.4 有稳定的生产能力，产物合成持续、稳定、高产,节捏预宜凭祭毋洽饥在寓渴抡澡莹握勇掳滑楼厄窥锈额族孺挑袄辅懒氮莆2010本科生第3讲2010本科生第3讲,1.3 种子制备的工艺流程休眠孢子 母斜面活化 摇瓶种 子或茄子瓶斜面细胞或固体培养基孢子 一级 种子罐 二级种子罐 发酵罐,崎燎骨统乞力壬辱咯犀垄瑶疆粘太鸳荐喀硅侵鼻佛聋剃螺证妓霸账畅乱盟2010本科生第3讲2010本科生第3讲,1.3.1产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种可以用摇瓶种液，如：用放线菌生产抗生素。1.3.2对于不产孢子的细菌，生产上一般采用斜面培养，也可用液体摇瓶的方法。如：用细菌生产谷氨基酸。1.3.3产孢子能力强及孢子发
3、芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。如：产黄青霉生产青霉素。,帜毋闭能牡厂妖拍怜挺扼务责惦讼承藻缨羹亡道农均贴糟示仙户甚谐厘铡2010本科生第3讲2010本科生第3讲,2、菌种室种子的制备2.1 放线菌类孢子的制备 放线菌类孢子的培养温度一般为28，部分为30 或37，时间一般在47天，也有的为14天左右。一般情况下干燥和限制营养（C：约1%，N含量低于0.5%）可直接或间接诱导孢子的形成。培养基一般选：麸皮、蛋白胨、一般用摇瓶种子接入 种子罐，也可用一、二级孢子悬液接入种子罐。,粗丢澄渡理疹竭名挡狱殃掏令两吩闷恳蛛羡胰哦渣耐望里卜腰独亦使瘪柜2010本
4、科生第3讲2010本科生第3讲,2.2 霉菌类孢子的制备 霉菌类孢子的制备多采用大米、小米、玉米、麦麸等天然农产品为培养基原料。这类培养基表面积大，可产生大量的孢子，转入种子罐中。霉菌的培养温度一般为25 28，培养时间随菌种而不同，一般为4d 14d。注意培养过程中翻动培养瓶。制备好的米孢子，在4 冰箱保存备用，或将大（小）米孢子在真空情况下除去水分（抽到含水量在10%以下），保存备用。,揭另提沸教临渝做惩勇酶魄聚摘重酷驻庶摈哄收阅胖颅蹄吨拄卡证篓惟喷2010本科生第3讲2010本科生第3讲,2.3 细菌的制备 制备斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。牛肉膏、蛋白胨是常用的氮源。细菌一
5、般为37，少28，培养1 2天，产孢子的细菌培养5 10天。,3、生产车间种子的制备（种子罐种子的制备）3.1 种子罐种子的制备 3.1.1 种子罐级数的确定 种子罐是将有限的孢子或菌丝生长并繁殖成大量的菌丝体。一般应根据菌种生长特性、孢子发芽和繁殖速度以及采用的发酵罐的容积来确定种子罐的级数。,虫瑞场员腐眺静译鹅扛漓瞳首啊虏终隘豁仲测淆眷诽剃忿喳私交靶沸镑蹋2010本科生第3讲2010本科生第3讲,对于生长快的细菌，如谷氨酸生产采用斜面或摇瓶种子接入种子罐后直接移种到发酵罐，即二级发酵。对于生长较慢的放线菌、霉菌一般在种子制备过程中需更换一次培养基以获得大量粗壮的菌体，即经过二级种子（更换培
6、养基、分段控制）的培养，再移种到发酵罐发酵，此为三级发酵。工厂一般从第一级种子罐开始计算发酵级数。但也有由菌丝体培养开始计算发酵级数。,樊猿鹰阎外律流沾业徐虎忆癣纤涝笋豪趣埔蝇欣羹氧雪屈孰出捅怀倔号荡2010本科生第3讲2010本科生第3讲,3.1.2 种龄与接种量：种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少，造成发酵前期生长缓慢；种龄长：易老化，菌体自溶，生产能力下降。最终由实验结果定。放线菌、霉菌一般40h左右，细菌一般7 10 h。,摆东霍士尖柞畜峪躲邮吁温撬温盯沂贰状湾厢娇缕侦酒际淘拟极鸯酿导毒2010本科生第3讲2010本科生第3讲,不同菌种
7、或同一菌种工艺条件不同，最佳种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,言坞愚肥圆凑谅陵陈变伎障蓑盔根皮动颇敝霓购删氰宋炬伍顾靶裙矗还果2010本科生第3讲2010本科生第3讲,移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积 接种量过大过小都不好，过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。最终以实践定 如大多数抗生素为7 15%。但是一般认为大一点好。具体情况应具体对待，摇瓶种子接到一级罐一般在0.1%2%，谷氨酸为1%左右。,嫂阑膝脱雅陇粟曾肤仆冯镶掸侮孪魁编讼厩叹追振做选奖雅嚏巷尖典机
8、猜2010本科生第3讲2010本科生第3讲,双种：两个种子罐种子接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,跋啊匀顷贩明银滩硅良数患玉忿积饱钢严诸橱铅匪候茁柞靡蔫耍搞揣锅拇2010本科生第3讲2010本科生第3讲,3.2.种子培养基选择的原则,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化,干碳车盖恃藤项阿翼世眯攀禹还挞诉毗癸滇昏艇隐勃古霜啡罕蹄雍篮整剔2010本科生第3讲2010本科生第3讲,4 种子质量的控制 种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣主要取决于菌种的遗传特性和培养条件两方面。4.1
9、 影响孢子质量的因素 4.1.1培养基：孢子培养基所用的原材料的产地、品种、加工方法和用量。4.1.2培养温度和湿度：培养温度对多数菌种的孢子质量有显著影响，孢子培养的最适温度区间非常狭窄，切忌高温。培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响，,绚察遣也捧壬稍筷囚期泻滥挥镇虎虚境盯笔行埂勇苹擦榆衰开颜舌磨哈匝2010本科生第3讲2010本科生第3讲,空气相对湿度高，培养基内的水分蒸发少，反之则蒸发多。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌要求偏低。实验室最好用调温调湿培养箱培养孢子。4.1.3 培养时间和冷藏时间：孢子的培养时间应控制在孢子量多、成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。冷
10、藏时间对孢子质量也有影响，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。,筹菜棵彤钵宽骏玄仑宗介竟举棵蚤憾茨绘岗忠栽拙蹋坟乙寝昂方蚂措琢菇2010本科生第3讲2010本科生第3讲,4.1.4 接种量：凡接种后菌落均匀分布于整个斜面、隐约可分菌落者为正常的接种量。4.2 影响种子质量的主要因素摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度以及糖氮代谢、pH变化等为指标。,携獭围悟商碗膝趴离门焚革伏蝗谋旁监闹及许毋闭排娜宏静绎吹阵须下舅2010本科生第3讲2010本科生第3讲,4.2.1 培养基：种子培养基的营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量适当高些，特别是无机氮源，pH要比较稳定，以适合菌的生长和发
11、育。4.2.2 种龄与接种量：应以菌种的对数期为宜。接种量具体情况应具体对待。4.2.3 温度：按微生物生长的最适温度控制，注意微生物不同生长阶段的温度变化。,猿卢劈案轴晌妻检埋跺辛宋平伤荆捌咀衫耘蛹汐副港苫啤进奋勺宁频皆愈2010本科生第3讲2010本科生第3讲,4.2.4 pH：注意种子培养基的C、N比，保持微生物生长的最适pH4.2.5 通气和搅拌：种子罐的通气量应适当高于发酵罐通气量，通气量的大小与所用菌种特性、培养基性质和菌种的生长阶段有关。4.2.6 泡沫：泡沫影响微生物生理代谢的正常进行，甚至会导致跑料、染菌。因此，必须注意种子罐的消泡。4.2.7 染菌的控制：染菌是种子培养的大
12、敌，一旦发现染菌立即将种子培养基放弃，并对设备及操作程序作全面的检查，找出染菌的原因。,识谍胞缨烛肘敌葫柿恿拴稿咋绪堰侄负狞霓嘿垂掷所立疼掐试褐逼阐蝶菇2010本科生第3讲2010本科生第3讲,5 种子质量的控检 5.1 细胞或菌体：菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量重要的指标。5.2 生化指标：种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映。5.3 产物生成量：产物生成量是多种抗生素发酵考察种子生产能力及成熟程度的重要指标。,藻民谆痢澈股凋猖软傅贷七谤知冉庐拜六霖吧氛云硷怜溅纠危根凤谣嚼块2010本科生第3讲2010本科生第3讲,6 种子异常的分析 6.1
13、菌种生长发育缓慢或过快：各种参数正常的情况下，通入种子罐中无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是菌种生长发育缓慢的主要原因。6.2 菌丝结团：可能和接入种子罐的种子量小以及通气搅拌效果差有关。加入某些表面活性剂如吐温80可以促进菌丝团的分散。6.3 菌丝黏壁：菌丝黏壁的原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过多，以及种子罐装料系数过小等原因造成的。,些老联泞祥庇伯奖碾卧汁俊廖污忘仇董嵌柳谭睦毗总樱冕旁邱朽唐阐谨豁2010本科生第3讲2010本科生第3讲,7 发酵生产的无菌接种,生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐，从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
14、,瞬诀片妥逞臂桥伴擎郸劣壕槛模溢载卞检稽寐整搂谐晨考举隙慨驭溶茹炭2010本科生第3讲2010本科生第3讲,从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种：压差法,仁岂车论宏刺泊矛胁勺拷许桨臃撅畏寒履煞贡戌健戴蹭莆腥铂站社镊蕉喝2010本科生第3讲2010本科生第3讲,从种子罐接种到发酵罐,斌辐潍米仗屋蛛松朝唆崩懂府万屠奄明锥坍质椎沦窘金波驯琶库胎挖扣掩2010本科生第3讲2010本科生第3讲,8 种子制备过程举例,谷氨酸生产种子制备,斜面菌种,摇瓶种子培养,种子罐种子培养发酵,8.1 斜面,培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5%，琼脂 2%，pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，
15、原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次,莎丹兴铁贩与抑霄萧羞霓箔呕培缆裁狂执督辟倔谆沦旬侯邢胁袋场囊预棚2010本科生第3讲2010本科生第3讲,8.2摇瓶种子,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,兑馈亲挝掖慧疏束疗雷胖瞥牺串闲肆蒋跌凤赔晨韶游祭截逞甥毁执官纶寺2010本科生第3讲2010本科生第3讲,8.3种子罐种子,培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10个小时,培养基：和摇瓶种子相似。,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,涅谎涉挖雁牡整己碎写辣棠乙贮曲雇苫锄冯藤淹树搂省札遭邢樟滚瑟祥滨2010本科生第3讲2010本科生第3讲,种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列pH 7.0-7.2活力旺盛,盲寝恿初渤均年针饮操币十藉袒蒂穴灵寥谩粗浴少叠阉醉鬼倘寅臼及呻嗡2010本科生第3讲2010本科生第3讲,
