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1、细胞培养操作及其注意事项,易红飞20121116,壤手常誉甩迅减竿真哩砚寐色尺闽稻猜响毡缅矢祖颅壹瞥疟求觉鸭札侄年细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,一、准备工作,1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。2.从冰箱拿出试剂（培养基，胰蛋白酶，PBS等），放在室温条件下，或37水浴。水浴箱中水应常换，从水浴箱中拿出东西要擦干，喷酒精。3.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如移液器和枪头盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带
2、入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。4.操作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。用酒精擦拭手套后才可进行操作。5.实验服应该定期灭菌和更换。进出细胞间时，不要同时打开相邻两个房间的门。,孕氟辞喷轰蕾蹄有宏郴军筒棒州合问痛寅嘱矾赎择络翻咳桶捣砾牺斩卖描细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,二、贴壁细胞的换液及传代,1.换液当培养基中有较多漂浮的死细胞或者培养基颜色变黄，而细胞密度未达到60%左右时，可只考虑换液而暂时不进行传代。吸弃原培养液或直接倒弃，加入新的培养液。注意：对于一些贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞），加入新培
3、养液时应把枪头贴于器皿壁上缓慢注加，或需要避免更换枪头时，可考虑滴加于器皿壁上，以免把已贴壁的细胞吹起。）,拯有样评腮蓉斌坦祟癸乌嘉哮氟柱涕化韵亦妓遗瞥阮郁会跑蛇拙逝条钨具细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,2.传代当细胞密度达到70%-80%时，需要进行传代。吸弃或者倒弃原培养液。加入适量PBS以漂洗除去残余的原培养液。加入适量的胰蛋白酶，混匀后放置培养箱37孵育1-3分钟。观察细胞消化情况。加入完全培养基以终止消化。按比例把细胞传到新的培养皿中。放置细胞培养箱中培养。,柜剪侄竣碾茁搏尹奔嘶困帝蹲盐制斯棒骤宁咋佳答粟辉逆姨诈拱锑膛旷鲍细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意
4、事项,注意：判断细胞是否要传代的准则是不能让细胞生长密度大于80%。血清中有抑制胰蛋白酶的成分。加入的胰蛋白酶的量不能太多，只要稍微能覆盖细胞层面即可。若加入的胰蛋白酶较多，会伤害细胞且有可能反而降低消化效率。孵育时间不能过长，否者对细胞照成伤害。一般来说1-3分钟足够，尽量不要超过5分钟。贴壁较牢固的细胞株（如4T1细胞株），需要孵育时间较长，而贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞株），需要孵育时间较短。一般来说，细胞生长密度较大时，需要孵育时间较长。不需要专门离心以去除胰蛋白酶，加入完全培养基即可。若需要去除胰蛋白酶，可离心弃上清以除去胰蛋白酶。根据细胞生长速度的不同选择不同的传代比例。尽
5、量不要使用原培养皿，因为经胰蛋白酶处理后的培养皿表面涂层会发生变化，会在一定程度上影响细胞的性状。,充景丢楼聚遵只赵换侄品进伸别河势漫吸韩壳混唇戳甘捅超枕岂可怕糙晤细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,三、细胞计数及存活率检测,肿聋披徊诱甄丹屑勤唱掠螺刘秋钎距被揭苑躁吁鼓翼塘榷嗡泥旧措跑咎秋细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池划有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大格，每个大格面积1.0mm2。容积为0.1mm3，其中，中央大方格用双线双成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细
6、胞计数区域，用单划线分为16个中方格。当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。计算公式 细胞数（4个角大方格区域内的细胞数之和/4)104稀释倍数细胞悬液总体积细胞计数板用后要清洗，切勿用硬物洗刷。,负恬思柯司冈缉馅陡孤货堵增阔毯廊计焚打示哑纬马矗蚌卢狗啪绰贞液缮细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,细胞存活率检测,原理：采用台盼蓝据染法区分死活细胞，正常健康细胞能够排斥台盼蓝，而丧失细胞膜完整性的细胞可以被台盼蓝染色研制而成。严格来说，台盼蓝检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。商品化的0.4%台盼蓝染液，或自行配制（台
7、盼蓝用生理盐水溶解）直接向欲计数的细胞悬液中加入等体积的台盼蓝染液，轻轻混匀，染色3分钟，不宜超过10分钟。然后计数。细胞存活率=（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数100%,噪辊员慕泅捏蝶冤吓踌谢阀因苗则磷卫贿贫答刊趴瓦懂榴滋讹熔潜饱髓夸细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,四、细胞冻存,1.冷冻前检测细胞是否保有其特有性质。2.DMSO应为试剂级等级，无菌且无色。小体积分装，4避光保存，勿做多次解冻。10%浓度配制冻存液。3.由于DMSO稀释时会放出大量热量，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。4.adherent tumor lines:5-7 x 106
8、，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。other suspensions:5-10 x 106 cells/ml,human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。5.回收动物细胞，其离心速率一般为300g(约1,000rpm），过高的转速，将照成细胞死亡。,馒错史恼汗擂悟讲寺鸡愈励锑财法遁雾译坡麓缴个聋义疡娇驴研挪场番坎细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,五、细胞复苏,1.37解冻时，注意水面不可超过冷冻管沿，否者易发生污染情况。冷冻管由液氮中取出解冻时，必须注意安全，预防
9、冷冻管爆裂。2.除少数特别注明对DSMO敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入新鲜培养基中，待隔天再置换新鲜培养基以除去DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴壁的问题。3.解冻后应迅速放入培养基中培养，切勿在冻存管中放置太久。,宠御霸衫营淌拖溺欣瓶宛匪至好和钡菠堰厨碳浮谅绕悉肆佛匹路巧诌汉睬细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,六、操作完处理,1.试剂瓶瓶口喷酒精，用封口膜封住后，拿回冰箱应该放置的位置。2.清理工作台面，并用酒精消毒。下拉门，开紫外照射一般30分钟。3.垃圾袋封口，拿出高压蒸气灭菌（如果有感染试剂）。4.关掉37水浴箱的电源，细胞培养箱CO2浓度恢复至5%后，关掉房间日光灯，离开时在相应房间脱掉实验服和拖鞋。,残库曙鼠群翠里阎贫索翰省曝侈枝苞眨华皑攫士辜真宴瞧长钱掉涯胆微哉细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,拱吓歧葡绎葫帜诧卫舱铸倦优很旨侈肋标炙佛沿疯映胀技饺致呛旋陌螟胖细胞培养操作及其注意事项细胞培养操作及其注意事项,
