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1、-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛及酶活力测定,目的要求,了解利用微生物摇瓶发酵初筛的目的。了解发酵用培养基的配制要求。掌握碘比色法（部颁标准）测定-淀粉酶活力的原理和方法步骤。,发酵培养基（100mL装于500mL三角瓶）,可溶性淀粉 8g；豆粕粉 4g；Na2HPO4.12H2O 0.8g；（NH4）2SO4 0.4g；CaCl2 0.2gNH4Cl 0.15g；CaCO3 0.15g水100mL121.3灭菌20分钟,发酵培养基配制说明,三角瓶规格要统一。先将不溶解的可溶性淀粉、豆粕粉、CaCO3分别称于500mL三角瓶。将无机盐称量后先溶解于水中，调节pH为7.07.5，再用量筒量取100mL加
2、于三角瓶中，轻摇混匀。121.3灭菌20分钟灭完菌后取出，要马上轻摇混匀（？）。,种子培养基（下周使用）,可溶性淀粉 3g；Na2HPO4.12H2O 0.4g；（NH4）2SO4 0.2g；CaCl2 0.2gNH4Cl 0.15g；4%豆粕粉浸出液 100mL煮沸使淀粉溶解后，取50mL分装于250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分装于18180mm试管中（5支），加塞包扎。121.3灭菌20分钟,其它器材,1mL无菌吸管 10支2mL无菌吸管 5支,相关碘液的配制,碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，
3、洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用。比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色瓶内。,pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：,pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O7.H2O）7.74g，先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。,2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制,2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在
4、搅拌下注入沸腾的700mL蒸馏水中，继续煮沸一分钟（透明），冷却后用pH6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至1000ml。标准糊精溶液：取0.06克化学纯糊精悬于少量水中调匀，然后倾入90毫升正在煮沸腾的蒸馏水中，冷却后定容至100毫升，滴加数滴甲苯（现配现用就不用加），冰箱保存。,标准终点色溶液,1、第一种标准终点色溶液取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。2、第二种标准终点色溶液A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml。B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml。同时取A液40ml、B液5ml、
5、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。,方法及步骤,发酵培养基灭菌冷却后，利用接种环接种一环上周培养好的斜面菌种。37 摇瓶培养（往复式110转/分钟）2天。2天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。测定发酵液中-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。根据结果选出12株进行下周的复筛试验。,所选菌株产-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排,上课前一天下午17：0017：30将斜面菌种接种一环于5mL种子培养基中（装于18180mL），37 摇瓶培养（旋转式150转/分钟）1416hr。上课当天上午8：008：30将上述摇瓶培养好的菌种，用1mL无菌吸管吸取1mL接种于50mL种子培养基中（装于250mL三角瓶
6、），37 摇瓶培养（旋转式150转/分钟）810hr。,所选菌株产-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排,当天上课时间制备发酵培养基，35瓶/株菌（100mL/瓶），灭菌。将摇瓶培养好的菌种，用2mL无菌吸管吸取2mL接种于100mL发酵培养基中（装于500mL三角瓶），37 摇瓶培养（旋往复式110转/分钟）2天。2天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。测定发酵液中-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。根据结果可以判断所选菌株产酶能力是否稳定。,实验-淀粉酶活力测定方法介绍,酶活力测定的方法,碘比色法（有相应的国家标准）在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位3，5-二硝基水杨酸比色
7、法（DNS法）在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位 注意：去除-淀粉酶的干扰医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速）,-淀粉酶酶活力测定的原理,底物（反应物）为淀粉产物为麦芽糖、糊精等,酶活力测定（碘比色法目视）,酶活力定义：在60下1小时内将1克淀粉转化为糊精的酶量称一个酶活力单位（510分钟反应完成）。淀粉及糊精检测原理：碘检测 淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精，7分子以下）麦芽糖（不显色）葡萄糖（不显色）计算公式：,酶活力测定步骤,对微生物酶发酵研究中的一些问题进行讨论,标准曲线制作的问题
8、（配制所需测定物质的梯度浓度）酶的诱导问题（微生物长期适应进化的结果）酶发酵中氮源问题（蛋白质合成的一些问题）酶的合成中能量问题（需要消耗大量的能量）摇瓶发酵中的容量问题（三角瓶，250、500ml）发酵中的溶解氧问题缓冲液的配制问题在-淀粉酶发酵培养基中CaCl2的使用问题在摇瓶发酵中非可溶性物质的加入问题化学分析中基准物的处理（纯度、结晶水的处理不稳定）,相关概念的介绍,复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生长性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚在未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施
9、，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。,相关概念的介绍,菌种活化使保藏的菌种（休眠状态）恢复到最佳生长状态（包括一些菌种性能的恢复），生长状态的均一化（相对）。一般包括：斜面活化（平板划线形成单菌落）；液体摇瓶培养；种子培养（针对大规模工业生产）,相关概念的介绍,种子培养基：营养成分相对丰富，一般无限制性因子，有利于菌体的增殖，生长好；发酵培养基：营养成分有利于积累所需代谢产物，一般在培养基有一些限制性因子（包括培养条件）。注意：种子培养基接种于发酵培养基时，注意微生物生长延滞期（有一定营养成分重叠）。,实验室摇
10、瓶机（摇床）的作用,使培养基一直保持均匀状态菌体始终接触到新的营养成分（相对来说）；快速稀释代谢废物（一般对细胞有毒害作用，对人类来说可能有用）增加培养基中溶解氧的浓度，提高菌种的有氧代谢强度，加快物质的转化，有利于代谢产物的合成和积累。,摇瓶机的种类,旋转式转速相应较高（200转以上），培养液贴壁旋转；往复式转速不易太高，一般120转/分左右，培养液来回振荡，振荡液面较高；往复式的溶氧效果较好（相对旋转式）；注意摇瓶机的振幅（偏心距）。,摇瓶发酵试验时三角瓶装量的要求,一般要求装液量为三角瓶标注容量的1/101/5如500ml三角瓶经常加入50100ml（常装50ml或100ml）；如250ml三角瓶经常加入2550ml（常装50ml）；注意：根据需要可以特制（如加挡板，增加溶解氧）。,菌种,斜面菌种活化（1824hr）液体摇瓶活化（1824hr）接种摇瓶发酵培养（2%，4872hr）,液体菌种活化培养基（种子培养基）,可以利用微生物实验书的淀粉培养基，注意调节pH值；也可以利用发酵培养基（豆粕粉需要煮水后使用）；,培养,接种需发酵测定的菌种活化培养液，1mL/瓶（接种量2-5%，实验前后统一）。37，摇瓶振荡培养2-3天。,
