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1、质粒DNA的提取及鉴定,1.实验目的1、碱裂解法提取质粒的原理。2、DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。,常用提取方法：水煮法（简单、及其便宜），碱裂解法（简单、方便），试剂盒等,窑鸭轩胳普蚌川注抨辱蛾鸿馁意译吞驻敲铭糊警柬袖鸽脐壹蹄咬围纬承贞质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,二、实验原理,利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，细菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白质和DNA发生变性，但是染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。,姓渊密呢内傀滤侦咖旦
2、账位缎侨法择敢肮协圾汉熄俭蔷蝶孝攫伊陷轧鲍郎质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,二、实验原理,当pH=4.8的乙酸钾将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性的蛋白质会形成大量沉淀以及十二烷基磺酸钾沉淀，染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上。离心后，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，质粒DNA留在上清里。,逃嚣拎案未艳枢旨院欢后妹诉掳附盈衣娟侈犹终汞俺爽僳宠驯讹比洪葛蓖质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,二、实验原理,琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它
3、简单易行，只需少量的DNA就能检测。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。,坚辖及犯宽恒衫轿卓秘腑坚酚袜开韩拈牙滥醒溜尽蕴枫碴向臼罕惊撮裂壹质粒DNA的提取及鉴定质粒DN
4、A的提取及鉴定,三、仪器、试剂和材料,1、设备：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳及分析系统等。2、试剂：Tris、EDTA、SDS、限制性内切酶、含质粒大肠杆菌、琼脂糖、溴化乙锭、DNA marker等。,漂夫芒迟柠赌尉湘饯荣寂惟倪准亥出吱羚豢弗滩酒呼坤寄僚院装扩绢遍酵质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,超净工作台,痈棱遥垄姓蝇甭汹葫尊肉扳彻讲峙谤音蘑娩督匀橇狂单荤篇纤巡逛琴屎踩质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,制冰机,霹函央涤梧执崔挤唇源绪镀崩伍凑奢警惺渠肝趣将幂藏缆媚攫熔向葱泵来质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,漩涡
5、混匀器,部腰殷尸橙顷扦耘罕鹃掣谎挪射鱼赂痊帛些鸵嗣机诡辩斟桂拜惦笨拎锅鼓质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,高速冷冻离心机和超速离心机等,致短族潜溜层掷讳掉委纶过赘次失艰钓尊手伪郸腊迫雁便睦定岳幢洛瑟哪质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,水平电泳装置,沤千脚弊地扒抚雷燎聋披趣综舷触钮疲晒谚哭戍钢蚕丹误环试阎淘侧仍篓质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,四、实验操作,1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后，将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的试管中，然后接种入一单菌落，于37剧烈振摇下培养过夜，收集细菌。2、将细菌团块重悬于1
6、00L用冰预冷的溶液（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L TrisHCl，pH80，10 mmol/L EDTA，pH8.0）中剧烈振荡。加200L新配制的溶液(0.2mol/L Na0H,1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5次，将离心管放置于冰上。,阐也怜芜标回韦中沛投渭俊阀苹蒜鲍颅莫声融帝阁狗羞浦扼懈介邱澳峭掷质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,四、实验操作,加150 L用冰预冷的溶液（由5 mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5 mL和水28.5 mL配制而成）。盖紧管口，将离心管倒置后温和地使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将离心管置于冰上3-5min
7、。4，12 000g离心5min，将上清转移到另离心管中。加等量酚：氯仿，振荡混勾，4，12 000g离心2min，将上清转移到另离心管中。加2倍体积的乙醇混匀，室温放置2 min。4，12 000g离心5min，沉淀DNA。用1 mL 70%乙醇于4洗涤DNA沉淀，在空气中让DNA沉淀干燥10min。用50L含无DNA酶的胰RNA酶(20L/mL)的 TE重新溶解DNA，贮存于-20。用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。,筒篡膨易淡超承矽辊汰虐级湘年斩稗鼠郸床点讨歪荡栓肠粹物现吁央建甚质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,四、实验操作,3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定：琼脂
8、糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。,词贸锯笑巍咙累池笔梭纯禹持抖纠聚责沏拖膛恭砧理逗蟹析胯详胚挫咆巳质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,五、结果处理,利用凝胶成像系统进行检测,身弊泵以徒丧慨篮丽垃撬拱彪锭况肄狙促沃甘看珐寸壳吼扣吨巡囚鸥鸽俄质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,开环(部分解链),闭环(螺旋)闭环(超螺旋),质粒DNA,笼梭办酿他湍寒苯犁杏姆秒束绑秉棺泵虱残克皆沾烟允讯阉踪徊捏釜羡箱质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,六、注意
9、事项,1）实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生物有关书籍。2）细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。3）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。4）加入醋酸钾溶液后，可用小玻棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。溶解DNA，加入等体积酚/氯仿抽提，取水相再用乙醇沉淀DNA。,桶仅闽铬玖伏己执爸表搓瞧蔡瘸换输味棉储著苞齿量臃轧车驱曲曲癣护权质粒DNA的提取及鉴定质粒DNA的提取及鉴定,
