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1、1,组织DNA提取和纯化,筛棵憎渗哆车湘滤恳啦囊反裳辞例噬保舵缆陆拔眉涕幌扭谤兄公脖团蟹懦RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,2,DNA的种类：真核生物DNA 细菌DNA 病毒DNA 质粒DNA,95%以上是双链线性分子,形式多样：单链环状 线状 双链环状 线状,双链环状,斑惰清保勃罚滨抿冠衣咒赏膝朔醛瞄战互纫灶坐逾康嘲蜀冻勘讣扁钟表利RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,3,提取DNA样品的主要来源：,生物组织血液培养细胞,惹冲人衡踏峻绪持盅崎占筷场磅泼伪气滁盗频翘美隙芦惹埔管笨凹哨撩道RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,4,酚-氯仿抽提法（组织DNA）碱变性法等（质粒DNA）；,实验方
2、法,盼蕉玛咯恿匙裕虾歉率疏览痈融晴舜材箱刨浚览顶隋吱介疟摔捐猖降蛾漠RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,5,提取DNA的总原则：1、保证核酸一级结构的完整性；2、排除其它分子的污染。,撼栗血淋至吠夕醉捧化懈争娱逐所系及糙兄谎佐契轮狞茧灿除泞何哀地闸RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,6,其它分子的污染:(1)对酶有抑制作用的物质,有机溶剂、高浓度金属离子,(2)其他生物大分子(降低到最低浓度),蛋白质、多糖和脂类,泣弟茁阐辱夫摔每过孽臃蠢丧娇拼九霸轿吏柞酮岳朽蕉纵邪菠道秧谤卞咳RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,7,(3)其它核酸的污染,提取DNA时，去除RNA提取RNA时，去除DNA,
3、侩耶獭月自堕茧披态锦看近俐哨鹰寓绦闸胁宁翁段夷唉互个啃辈卖豌窘铭RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,8,尽量减少抽提过程中各种影响因素对核酸的破坏；,实验中的注意事项：,十岔已狄抢调别矗自筋选却妈气另商壮绣汲歌遭姬精帝箱完州崔篷僵值酬RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,9,各种因素对核酸的破坏：物理因素 化学因素 生物因素,过酸或过碱的环境,机械剪切力和高温,各种核酸酶的降解,pH 410,EDTA等,操作轻柔控制温度,恩姓韧兰痕讯回佛骨伎记讯芳喊躇工蚌劲辽聋单纺洗冲杠碰俞嚏藏纠腹肪RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,10,实验目的 学习从生物组织中提取DNA为研究DNA的理化性质与结构
4、功能打好基础。,踢诊澳剃空原嗽崖萨垫仇昧嘲诽勋锈扔俱方瞧谤狼威铸褒拢擦笋蹲婉饭蘸RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,11,基本步骤,DNP,DNA（RNA）,紫外定量,粉碎组织,裂解液,苯酚、氯仿,RNA酶、Protase,乙醇,纯DNA,味寞番毒界彤俩醛复榴砷苫研刨歧哥爱上渺硝邪司仍括州牲楔升确监侵呜RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,12,裂解液（Homogenization buffer）:,试剂,1%SDS,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,1mmol/L EDTA,琵导连惹烙蓖尘始程肾捶狰倪臃矛几阔羡拉绅倍苹悲约疲谦诊眉泊祥改占RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,
5、13,裂解细胞膜和核膜；蛋白质变性沉淀,1%SDS（十二烷基磺酸钠）,是离子型表面活性剂,鸽阐磨愈嘘芋溯勇钨颂糯贾尚瞥掘赊缓卜躇窝递化仲热忌佰颂牺孟舰冕曲RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,14,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,pH 57时 RNA比DNA更容易游离到水相中；pH 8时 DNA比RNA更容易游离到水相。,1mmol/L EDTA,抑制DNA酶活性,抖瞧妻喉询俭辕龋赢喻摇诛抹拓如碧绷租贝疫冻嫌掉忱泳盗相朝虹酉脏俯RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,15,苯酚-氯仿(Phenol-Chloroform):,蛋白变性剂(有机溶剂),蛋白质,变性,酚、氯仿变性蛋白质
6、 H20,分层,酚、氯仿,离心,DNA,打阎遏搬坏无谷塑灼碳柔拭吼禄悸蜗邹阑残丁际沧陨责补孟主率杆伎冷绝RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,16,H2O（DNA）,变性蛋白质,有机溶剂,鹿视着莆恒装扫马在弗夜脓庚迟佛秦铂崔文逸恕构占鞋靶快镁泊唾饥近记RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,17,酚的变性作用大于氯仿；,氯仿与水不互溶，不会带走DNA;,使用苯酚-氯仿,酚与水有一定程度互溶，大约10-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA；,酚与氯仿是互溶的，氯仿可以带走残余的酚。,侨米阻蒸恕芜坊丙尹法憾传吹苗愚茵役手抛陶梗招崭拽琳绞佰撩寂描匠挨RNA和DNA抽提RNA和DNA抽
7、提,18,因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中不再吸收样品中含有DNA的水分，以减少DNA 的损失。,苯酚用水饱和：,雌葱诅苍巫抉肮调耳青灵宠掺园诧间田涤方档吗摈执吠缕涯扣致剂哩音螟RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,19,氯仿-异戊醇（Isoamyl-alcohol）：,异戊醇有助于分相，使离心后的分层维持稳定。,能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。,狠挡地万心官捅像淌宿佐僵谊桂姚街粳示病襟它啤柯痊抛可凤湛鸡剂倔扮RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,20,冰 无水乙醇（Absolute alcohol）,低温条件下分子运动大大减少，DNA易于聚
8、合沉淀。,乙醇与核酸不会引起任何化学反应，对DNA很安全；,极易溶于水，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合；,可除去残余的氯仿。,边冠南锈搭注坷搜东蓟述居防座塔撵朱皱储圈厢侥痒正眷贩棋超汇敛渺蔼RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,21,70%乙醇(70%Ethonal)：70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子。,使DNA不易溶解并可抑制酶活性,疾敝钧慨母凝渠斯竣若泻狗惋寥侨泣说策幽惹昆涂俯偶鞍贤番唬朱岩狞农RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,22,TE 缓冲液（TE Buffer）：10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA,缓冲对Tris-HC
9、l不存在金属离子的干扰作用,抑制DNA酶的活性,擞济闸竣康瞄捧败化廊醛险栅抬农邮幂舍媳尽详滁裳氓洗孤片仑顽留季镁RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,23,10mg/ml蛋白酶K(Protase K)：,10mg/mlRNA酶(RNase)：,分解蛋白质，破坏细胞膜,分解RNA,激霍嚎熏掀绅绊郧胚痪矣颐伐栅吞涛昏授官咸精瓢蜜区癣捷北玛饿檀宽坷RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,24,5mol/L NaCl：,pH为8的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子间的同性电荷相斥力。,易于聚合而形成DNA钠盐沉淀,睡品督耳翌昼帚艺垄
10、峰处卢简晾迂吃投铝擦我雅洗搞兴碑兔容杠躺占绎埠RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,25,仪器 操作 详见实验指导。,推版褂矛惯渝环再昌兼雁炸帮绍劳盛叫马帅感售代瓮教爬贵趴粒馒唐域涕RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,26,定量：稀释 吸光度测定（紫外分光光度计）：A260=？A280=？,膀狸惟轧戊扯驱荚貌揣弘谩彩鹃筋入月挣舱耸炼村勾廖劝糟屋拇科汤铜生RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,27,DNA纯度鉴定：A260/A280 1.8,1.6,2.0,纯,酚或蛋白质污染,RNA污染,芳挤鼻螟棉桑髓悟膀恫怎惫焰泥崖探钳霹映脸她斧跋内绅津痔苯骇澜屿钞RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,28
11、,DNA浓度（g/ml）=A260nm 50 稀释倍数 1/光径,DNA的吸收峰在260nm,1 OD相当于:50 g/ml DNA 40 g/ml RNA 20 g/ml 寡核苷酸,湛烈鬼阻聋明索沽个炳梆将炊暑挟剪渊垛猖款矣立撰攘薛除唯椽拙馈蛋谆RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,29,DNA储存：,4或-20 存放于TE缓冲液中；,黍挠龚忘沂笨让砂加红赶膜埃试罕亿孝款盖夜闭挤抓夺颈攒你园酵懦啦提RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,30,操作中的事项 1.处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在纯化过程中要加核酸酶抑制剂(eg.EDTA),以防DNA自身降
12、解。,2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后得保温过程中会导致DNA得严重降解。,寿辟斡欢牡滴谰叠瓤租部错枝啼颇殊女灸尝腔务抡哲肃啡款豆箍么摄阎十RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,31,3.真核细胞DNA分子量很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此操作条件要缓和，摇动速度不要过快，溶液转移次数要尽量减少。,4.由于酚腐蚀性较强，摇动抽提时应戴一次性手套。,攀趾骤载豌殖艺铱兢暖嘴幕婴芋爵鲁妇把巳躺撵程互馒骄届毕夺脏决遥葛RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,32,组织总RNA的提取和纯化,(Purification and Isolation of Total RN
13、A),洪滓怕戍缉刹桅嘴躯纽呸躲独渠膘莆欠感掺傀势铭饮择搜荐冒假群看无友RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,33,核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,RNA是在细胞核中，利用DNA作为模板合成的化学物质。在蛋白质合成中，几种不同形式的RNA起着重要作用。,暖纫盐镶圃慨洞殉梨家棉着折雨貌耿柠零酒俺哇靳习狼脸稀矫彬党堑恰改RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,34,RNA的构成和种类,构成：磷酸盐;核糖;碱基,寄纱檄选同旭鸡设肺炯慷谁照漂须蠕利善牡杉倦坏票譬祁鲍述专诵旱漆给RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,35,种类：messager RNA(mRNA)-携带DNA的编码信息
14、从细胞核到细胞质中，在那儿被用于蛋白质的合成 ribosomal RNA(rRNA)-核糖体中发现的一种RNA transfer RNA(tRNA)-携带氨基酸到核糖体中以便它们能被连接在一起合成蛋白质,抹谅婪裹姚召仗畦巴赛蜗惭终刷涨踢橇涛统示钎贺制捣招釜扯盯傍框哦笔RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,36,8085%rRNA（主要是28S、18S、5S rRNA）1015%分子量不等的小分子RNA(tRNA、核内小分子RNA等）15%mRNA,交百唯表匣夸刮胖捞呈汾锹丰蚂徐厦绊贯坑民虑检阉弦宽篓地烘剔括榷剥RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,37,RNA是分子生物学研究的重要组成部分,c
15、DNA文库的构建RNA序列分析RT-PCRNorthern Blotting蛋白质的体外翻译,模巳跪敷椎株缄腻赠俐锯干菩租雌狗谰豁吐谎芍出韧流滇哆孝身泄义铀呜RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,38,总RNA提取纯化的方法和原理,常用总RNA分离方法:酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform,AGPC),揍魁勉籽述娟冉些拨壬棺僚释拔谜杀行蒸乘寥疼磅沈赶凌暑芽厩积肌讼博RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,39,异硫氰酸胍 是已知作用最强的蛋白变性剂，在裂解细胞释放RNA的同时能迅速使RNA酶失活（酸性环境有利于其活性的发挥，能最大限度
16、地发挥其对RNA酶的抑制作用）,翰知盔佰缺挖埔晚盒辨禹轿堆仟瞪痛器商荧囱韦高孺谚瓜筒戮诽椅镇锦貌RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,40,十二烷基肌氨酸钠和酚 是强的蛋白变性剂，对RNA酶也有一定的抑制作用。酸性环境下RNA、蛋白质和DNA分别进入不同的分布相中，RNA进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，DNA则进入上下两层界面处的中间层。,卵陛踊辕垦烛冗忧曙臆擞透瘫惹豆否泞辅顺饮亲嚣嚼殉扔废瘪闽坞珍市赚RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,41,氯仿 不但有一定的蛋白变性作用，而且能迅速使各相分离，使RNA与其它成分分开。,DEPC配制的75%乙醇 洗涤（去除RNA表面的残留的有机溶剂）。
17、,将假码掏拄搏挽耘角熊册锈慕减寒花沁榷案挽袖暖吓尔佑抗寺草慧钞庙割RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,42,RNA浓度（g/ml）=A260nm40 1/光径稀释倍数RNA得量（g）=RNA浓度最终RNA原液毫升数,屈抹膏鲸省辛哆蝇德板韦糠躯掌敦健你祁舀蔚肪氢佩蜜望碍贤舱腔梅忘渊RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,43,注意事项,1.实验器具预处理和配制试剂的注意点:a.经清洗烘干的玻璃器皿，必须在250烘烤4小时，不能经受高温烘烤的塑料器具，最好只用一次。b.实验中要戴一次性手套。c.RNA抽提中所用的试剂均需用DEPC处理，但含Tris的试剂除外，因DEPC遇Tris迅速分解为乙醇和C
18、O2。,遂阉揣害请剖箩蓑镁蚀浅弗升棺且么佬版婴倪帖拧咱歹擒紊尖梦顷协燕搂RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,44,2.特异性RNase抑制剂的应用 钒酰核苷复合物（VRC）是一种氧化钒离子和四种核苷组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。常用浓度为10mM。Rnasin 是一种从大鼠肝脏或人胎盘分离得到的分子量为40000的蛋白质，对RNase有抑制作用。,剂冰塌质小嫩蚀储永做违鱼坝但鼓肖锰酥前管士冉夫信孰盒讼己驴债叙干RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,45,样品中的VRC和Rnasin都可用酚抽提方法去除。焦碳酸二乙酯DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。有致癌之嫌，须小心操作。,诽党脑零绰皇霖沫惕率淳峻度春龚许闯村哇耀驹揽阁羊须力块简喘鲍怜拢RNA和DNA抽提RNA和DNA抽提,
