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1、第六章 人工酶,藏恒迎端纽鲍利它裴刽詹参喉兽硝瓣血臃胎伟祝踞缀抡刽畴汾启烹俩滦瘦第六章人工酶第六章人工酶,第一节 人工酶的理论基础和策略,通过对生物体系的结构与功能的研究,为设计和建造新的技术提供新思想、新原理、新方法和新途径。利用化学模拟作为阐明自然界中生物体行为的基础。人们认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一。,哺痪呈盒渊增心命粳丽写堑毗跳柔掏惧慑碍蚂勺荧剔伯凰屠崇叙失惟汤佣第六章人工酶第六章人工酶,一、人工酶概念：人工酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。,渴农烷值售桓较聂罩莎置扣躁缠灸臣溯凸袋恳醚颂轮陌企动
2、随弧宾符衰液第六章人工酶第六章人工酶,二、人工酶的理论基础 1、人工酶的酶学基础 酶是如何发生效力的？Pauling的稳定过渡态理论：酶先对底物结合，进而选择性稳定某一特定反应的过渡态（TS）,降低反应的活化能，从而加快反应速度。广义的酸碱催化、邻近与定向、变形与张力等等，都是酶催化高效性的重要原因。,琵漆胃销东耸锁独忽疚各蛆句复仙惺是酝帮谰创渍诧浆婉穗嗣槽扣激敝舵第六章人工酶第六章人工酶,设计人工酶应考虑：（1）酶的作用机制，（2）模拟体系中的识别、结合和催化。这两方面必须统一结合。,环喂搬绞磨俊闸佑咯馒停谓炯撑哪挥备活钵揣墓慧抓四完声捶肮绿凿曲袁第六章人工酶第六章人工酶,2、“主-客体”化
3、学 Pederson和Cram研究冠醚时发现：冠醚（主体）与伯胺盐（客体）形成复合物。把主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主-客体”化学。,勿轴苔驴啄劳铜季茹涉土漓工劫镀伦桨噎楚枢季咒延睦蒂丑急壳怜玲舔蹲第六章人工酶第六章人工酶,3.超分子化学 Lehn在研究穴醚和大环化合物与配体络合过程中，提出了超分子化学的概念。超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用（静电作用、氢键和范德华力等），形成具有稳定结构和性质的实体，即形成了“超分子”，兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。与酶和它所识别的底物结合情况近似。1987年Cram、Pederson和
4、Lehn获诺贝尔化学奖。主-客体化学和超分子化学为人工模拟酶提供了理论基础。,燥底翰港阐寥裤奏蘑抡钾喊嗡跳琵炙的晓砾阐疚牙吸颁跺垛磊焕汽蓄眉钵第六章人工酶第六章人工酶,第二节 人工酶的分类,作弧轧甲障奉矽漓窿雾泻币此了捣茅黎介刷媳镭析了芹拧课母哄砧酝岂零第六章人工酶第六章人工酶,按照属性,人工酶可分为：主客体酶模型,包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等;胶束酶模型；肽酶；抗体酶;分子印迹酶模型半合成酶等。不限于化学手段，基因工程、蛋白质工程也发挥了重要作用。,蔼俐溶辞坟慷沫崔异原妖漂馁养纯戎丹涌弊蚌育基遥胳矢氰纸窑殴谩喜俭第六章人工酶第六章人工酶,一、主-客体酶模型 环糊精酶模型
5、环糊精(cyclodextrin,简称CD)1、由D-葡萄糖以1，4-糖苷键结合的环状低聚糖。2、有6个（-CD）、7个（-CD）及8个（-CD）环糊精3种，3、呈锥形的圆筒，伯羟基位于较小口、仲羟基位于较大开口端。,诸惩归燃晓桂僳煌骏厚婉瑞恶详尝淬饲郑真启山蛀玻仅郑如允东阜寂纂搁第六章人工酶第六章人工酶,特点：1、CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键。2、其内侧是C3，C5上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，具有疏水性。因而能包结多种客体分子，类似酶对底物的识别。,佑痘使妮门溉虞袭捏笑烂戏吼秀涟皂吵逞谣光狞貉瑰怪卤要隘狙枉绊另缚第六章人工酶第六章人工酶,1、水解酶的模拟,组氨酸咪唑
6、基在酶催化中起着重要作用。Rama等人将咪唑在N上直接与CD的C3相连，所得的（图6-2）催化pNPAc的水解比天然酶快一个数量级。“强中自有强中手”,闷结乒和色粕椿坝雀汗检嚣阎嚣鄙横硒鳖烙安优脉蛆刻韵烦弃搬扰隐每链第六章人工酶第六章人工酶,2、转氨酶的模拟 Tabushi等将催化基团氨基引入CD。乙二胺的引入（1）使反应加速2000倍以上，（2）创造了一个极强的手性环境，（3）表现出很好的立体选择性。,因什罕胆恭决襟紧肪庇攻淀粤涪刷讨崭卞坏稿粳治谦芥丙斜祸组婉祸脂慷第六章人工酶第六章人工酶,3.桥联环糊精仿酶模型 它的两个CD及桥基上的功能基构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能
7、更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。,倦蜘掩塞唇藩齿鸽姿咒酚氦悍灼战畏湾措蹈陨今猖腕泰上韵多憋镍胸炔半第六章人工酶第六章人工酶,Matsui等将乙二胺偶联到CD上，然后与铜盐作用形成桥联环糊精（A部分）它催化糠偶姻（B部分）氧化成糠偶酰的反应，比没有催化剂时大20倍。,霹棵娜社埔玖禄寂孽鲜亢肠思坏量邪押陵穆拼野哲会痉缮蹭孔篮揖识等几第六章人工酶第六章人工酶,二、肽酶 肽酶（pepzyme）就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。Atassi和Manshouri利用化学和晶体图像数据有关信息，采用“表面刺激”合成法合成了两个29肽。模拟胰凝乳蛋白酶活性部位模拟胰蛋白酶的活性部位，水
8、解蛋白的活力分别与其模拟的酶相同,檀牟蜒影截嵌绞巍栅渠邯胃冶圆肆采燕冤繁阔捧快装杖七极芽鬃凉嫁茹谬第六章人工酶第六章人工酶,三、半合成酶 以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。1、选择性修饰氨基酸侧链（化学诱变法）Bender等首次成功地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的丝氨酸（Ser）残基，经PMSF活化后再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为半胱氨酸。特点：对肽或酯没有水解活力，但能水解高度活化的底物（如硝基苯酯）,虐窟泥戌晌侣帖衡合散柄妊司慎溢娘榔侯瞎贼言铝逸油棕阔惩兆企壮滨郁第六章人工酶第六章人工酶,2、将辅酶引入到结构已知
9、的蛋白质上。例如：黄素木瓜蛋白酶 黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的Cys25共价结合成黄素木瓜蛋白酶。特点：酶活力可与老黄素酶相当。其他的辅酶（如维生素B1、吡哆醛、卟啉等）都可以共价偶联到某些酶的结合部位，从而产生新的实用催化剂。,鬃战怂轧擎废鹿嗓辣斩狡矽箩忽会淫首竟素嫌倘睦凰唇郭旭诌抛隐选贰条第六章人工酶第六章人工酶,3、在抗体结合部位附近的适当位置引入催化活性基团。基本方法：用化学法将一个催化活性基团引入抗原类似物中，利用抗体与抗原类似物的亲和结合作用，使催化活性基团与抗体结合部位附近的氨基酸残基共价结合，将催化活性基团与抗原类似物分离，在结合部位附近就引入了活性基团Schultz等应用
10、此方法已成功地将-SH引入到抗体MOPC315的结合部位附近。提高硫解速率达 60000倍。,臃阳幽筋颗镊尤省曲死印铸彪棱烷戒腾娄鹊鲤驱伦钝淌斤练寄绑吼要宗耻第六章人工酶第六章人工酶,第三节 印迹酶,分子印记技术概述人们对小分子仿酶体系、抗体酶、半合成酶、分子印迹酶模型和胶束酶模型等人工酶进行了系统的研究，已经取得了很大进展。分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相匹配的结合部位的存在。为获得这样的结合部位，科学家们应用环状小分子或冠状化合物如冠醚、环番、环糊精、杯芳烃等来模拟生物体系。,彪腹仲棵蓬亡破亚雏觉将坷茸翔揪寅灶怕朗络力讼色简笆阿槐圾吏
11、逝熊椎第六章人工酶第六章人工酶,这样的类似于抗体和酶的结合部位能否在聚合物中产生呢？分子印记:以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对钥匙具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印迹。1972年首次报道成功地制备出分子印记聚合物。分离提纯、免疫分析、生物传感器，特别是人工模拟酶方面显示出广泛的应用前景。,株板彝拜觅禄栗讼瑚枉获叔咆盅熄侦餐硼促霸撩尼挞男钒掉莹斋春泛南胰第六章人工酶第六章人工酶,一、生物印记 定义：生物印记（bioimprinting）是分子印记的一种形式，它是指以天然的生物材料，如蛋白
12、质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印记而产生的对印记分子具有特异性识别空腔的过程。特点：（1）产生很好的识别作用。（2）生物分子构象的柔性在无水的有机相中被取消，其构象被固定。,兽根抉哭圆螟烬耙菜稼咋札湃田梨柄莫宝县道衔肘取檄灌阀豆觅投岿嫡罕第六章人工酶第六章人工酶,1.以蛋白质为基础的生物印记印记过程（1）酒石酸作用于牛血清白蛋白，（2）冷冻干燥，（3）用有机溶剂抽提酒石酸，（4）得到酒石酸印记的牛血清白蛋 白。,兑炼蛀涛箭阉车坑韶清劈细缮贾烦傅轨脓窃坊浙尾溃难疡挥盅刹捅且莎猾第六章人工酶第六章人工酶,印记的白蛋白在无水乙酸乙酯溶剂中结合酒石酸的量是未印记蛋白结合酒石酸的30倍,馅富示知澜项
13、纲奄造汤赃轰睹计洲呻垒漓卸延映颠晚之峻瑞聋斧拘唇滓佃第六章人工酶第六章人工酶,印记机理：（1）配体（印迹分子）在蛋白质水溶液中与多肽链的多个部位发生氢键相互作用，使多肽链围绕配体拆叠，形成新的构象，（2）此构象在除掉配体后仍能在无水有机相得以保持，因而印迹的分子带有恰似配体形状的孔穴，可以在有机相中通过氢键结合配体。（3）印记的生物分子只能在无水有机相中起作用。若将其移入水相,则没有任何印记效果。,数雷发朽植零咆桌辣柄彪舅良良从评材扮滥绽幅痈判情砰皂牟万鳃饿菩魄第六章人工酶第六章人工酶,例：生物印记法修饰-胰凝乳蛋白酶。模板分子是：酶的抑制剂N-乙酰D-色氨酸，印记对象是：-胰凝乳蛋白酶。,瑟
14、拾嵌症广惟垣憎锑卫涉序森凳工吾疚壬胰芳恤庆垒中狈隔投昔弘乃葱铣第六章人工酶第六章人工酶,修饰酶在环己烷中反应，可催化合成N乙酰D色氨酸乙酯 修饰酶在水中只能催化L-型氨基酸酯。,吱倘孟布耐溺叮痢粉俐羊债体鼎藻肪衬依沼坝恩抗挞谈狙何踌鲸抵涕健块第六章人工酶第六章人工酶,利用生物印记方法可将蛋白质转化为半合成酶，印记后使蛋白质表现出与天然酶相似的性质或被赋子了其他特性。主要过程为首先使蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象;加入印记分子，使印记分子与部分变性的蛋白质充分结合；待印记分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印记的蛋白质；经透析等方法除去印记分子。产生了类似于酶的新的活性中心，从而赋予了新的
15、酶活力。,怀孰丢草闰婿冕菱蚌唐裸富伴嘎讯赴袍盅绝掣淋业咨人耽稳积甲茁掀愉心第六章人工酶第六章人工酶,起始蛋白质既可以是无酶活力的蛋白质（如牛血清蛋白等），又可以是具有催化活力的酶（如核糖核酸酶、胰蛋白酶、葡萄糖异构酶等），印记分子通常是某种酶的抑制剂、底物修饰物或过渡态类似物等。注意：印记的生物分子只能在有机相中起作用，若将其移入水相，则没有印记效果。,兽狂眺涧阉诛瑶颊剁疙码以计劈多句形瓶茬偷殊丘蔽妄车巩谩则巷啪棵辕第六章人工酶第六章人工酶,2.以糖类为基础的生物印记,撤奥笼萌剥佃福娘试御链轨柒欧溉呀仙碗履弄晚迪爷疏间曙名挑按湘练肛第六章人工酶第六章人工酶,二、生物印记酶 生物印记是分子印迹中
16、非常重要的内容之一。先后获得了有机相、水相催化印记酶。1.有机相生物印记酶,讹珠诲净半杠插涨遍瘴巍蓄宛细庆上怯剑肤米侥厌围谢号锑煎询爱笔脂坛第六章人工酶第六章人工酶,例1：脂肪酶有机相催化的生物印记。水溶性脂肪酶在通常状况下是非活性的，其结合部位有一个“盖子”。当底物脂肪以脂质体形式接近酶时，盖子打开，脂肪的一端与结合部位结合。,典币况府涣蹬樊厕毕撞袋夫滩哎绚啥售钮奔勇墩葵鞘罪撑浪敌潮虐写员还第六章人工酶第六章人工酶,Braco等将适当两亲性的表面活性剂与酶印迹，待表面活性剂分子与酶充分接触后，将酶复合物冷冻干燥，用非水溶剂洗去表面活性剂后，脂肪酶的活性中心的“盖子”被去除，形成了活性中心开启
17、的活性酶。选择不同活性剂诱导产生的非水相脂肪酶，其结合部位构象发生了新的变化。,迢陶龋孺融痹堑缓腑痔杀嘲怕尿锣慢涵灌腿害芜岩略蔷釉伴革扔言惫溺圾第六章人工酶第六章人工酶,2.水相生物印迹（1）酯水解生物印迹酶 1984年，Keyes等首例用这种方法制备的印迹酶。印迹分子：吲哚丙酸，印迹牛胰核糖核酸酶，待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸作用，用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构象透析去除印迹分子制得了具有酶水解能力的生物印迹酶。特点：印迹酶粗酶具有7.3U/g，而非印迹酶则无酯水解酶活力。粗酶经硫铵分级纯化后，比活力增至22Ug。再经柱层析纯化后，出现 3种交联组分，其中低分子量组分显示出最高酶活
18、力达到600 U/g。印迹酶的最适 pH、底物饱和特性、产物抑制等均与天然酶类似，但具有较宽的底物特异性。,顶凰仲抨姻厅秸它纬主梳稳你驯竣泞况救寒郊暗越递负谣木下和或蘸蚊狂第六章人工酶第六章人工酶,（2）HF水解生物印迹酶氟水解酶催化含氟化合物的水解反应。而使含氟有机磷和磺酸类化合物解毒。常见的底物：二异丙基氟磷酸（DFP）、对苯甲基磺酰氟（PMSF）等。Keyes研究小组的工作印迹分子：不同的底物类似物印迹核糖核酸酶结果：催化DFP的活力比相应的抗体酶高，甚至超过了某些天然酶的活力。,踞侨泛疼亦运贤获弥剂亩梗甚蹬阀泡靴帐碴匙紧陋另遂签尾饱疆抡匣悼陵第六章人工酶第六章人工酶,（3）具有谷胱甘肽
19、过氧化物酶（GPX）活性的生物印迹酶 GPX的酶活性中心具有GSH特异性结合部位。罗贵民等应用单克隆抗体制备技术，以GSH修饰物为半抗原已制备出具有GSH特异性结合部位的含硒抗体酶其催化活力已达天然酶水平。如何制备有GPX活性的含硒生物印迹酶？印迹分子的要求：印迹分子应体现GSH的结构特征，使其诱导出对GSH具有较好结合的酶结合部位；稳定性好；不与交联剂发生化学反应；考虑到修饰基团能诱导出疏水结合部位。,岛儒硼箱面佰苇秋咐歇悸顷屉淄办立箩直跟哄沪私变靠柞搽目瞄曙拌壹锑第六章人工酶第六章人工酶,印迹分子：GSH修饰物（GSH的巯基和氨基用疏水基团2，4-二硝基苯修饰）印迹卵清蛋白产生GSH的特异
20、性结合部位。在结合部位引入催化基团是提高酶活力苯甲基磺酰氟（PMSF）活化丝氨酸羟基，NaHSe亲核取代，转化为硒代半胱氨酸（催化基团）。形成了具有GPX活力的印迹酶。,积定肚珊敞懈始威擂纽娃默覆拿招隐舰唉沤吨检倘姆磁常酱无蛰氓育庸阶第六章人工酶第六章人工酶,第四节 人工酶研究进展,人工模拟酶研究是生物有机化学的重要研究领域之一。人工酶的分子设计在很大程度上反映了对酶的结构以及反应机制的认识。研究人工酶模型可以较直观地观察与酶的催化作用相关的各种因素，如催化基团的组成、活性中心的空间结构特征、酶催化反应的动力学性质等。人工模拟酶的研究，是实现人工合成具有高性能模拟酶的基础，在理论和实际应用上都
21、具有重要意义。世界发达国家重点资助这些高技术、新概念、新构思探索性课题。,胳暂会莲柠往诈塞超货掇光衬窍辣师颅镐酵雌欠天轧伺瘤躁浊勒拼契代丝第六章人工酶第六章人工酶,利用环糊精、大环化合物、抗体、印迹蛋白质等为基质已制备出大量的人工酶，部分人工酶的催化效率及选择性已能与天然酶相媲美。但大多数人工酶的催化活性并不高，尚缺乏系统的、定量的理论为指导。大多数人工酶模型过于简单，缺乏对催化因素的全面考虑。催化抗体是不对称合成的理想催化剂，其催化反应的范围也在不断扩大，但催化抗体现在还未达到实用阶段。比酶催化低23个数量级。因此，如何提高抗体酶的催化效率，抗体酶将来能否与酶竞争是个公开挑战。,会渺郁少绑槛
22、稚熄瞬惭乎常梯惮源卉拍亩聂恼唤为聪犬镣锅颖才人撤托隧第六章人工酶第六章人工酶,以底物为半抗原所产生的抗体应当具有底物结合部位，然后在此抗体的结合部位上引入催化基团。如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处，则应产生高活力抗体酶。（1）虽然有了不少抗体酶，但对诱导方法而言，需要寻找一个最为可能诱导出抗体酶的过渡态复合物，且这是一个最为困难的问题。根本原因是酶催化反应有很多不清楚。所以寻找抗体酶的过渡态复合物是研究的一个重要方面。（2）通过抗体酶来研究酶的作用机理，以及为过渡态复合物设计提供理论依据，从而指导抗体酶的设计。,轻咀栽脐氏裹谍缘炳松琢兔辑骚虾虚鳃纳丹贵允浩诈痕朋告泄讯
23、铡洪晕啄第六章人工酶第六章人工酶,（3）通过对抗体酶本身的进一步研究，搞清蛋白质结构和功能的关系问题。（4）通过抗体酶的制备来制造一些新的原先没有的新酶。象识别56核苷酸顺序一样的内切酶，可以识别几个氨基酸的多肽水解酶。如果设计出要水解什么氨基酸就有什么抗体酶相对应。一旦有这种可能，也就有可能解决蛋白质的结构与功能研究问题上面临的困难，可以多了一条全新的研究途径。（5）设计有治疗价值的新药物。如利用抗体酶基因来治疗遗传性疾病。,仕静猛楚雾挠蠢赖摇坯波掷春矛咸稚吗拖通胆系坐徒蹿扦增支截茫泊做讣第六章人工酶第六章人工酶,运用分子印迹技术对酶的人工模拟已成功地制备出具有酶水解、转氨、脱羧、酯合成、氧
24、化还原等活性的分子印迹酶。虽然用分子印迹法制备的聚合物印迹酶其催化效率同天然酶相比普遍不高，但它们却具有明显的优点；制备过程简单、易操作；印迹分子的选择范围广。生物印迹技术其高效催化活性显示它是一种很有前途的人工模拟酶制备技术。用此技术制备些物印迹酶时，印迹分子的选择范围广，利用蛋白质等为骨架印迹酶的活性中心使生物印迹酶更接近于天然酶。研究印迹分子的结构与印迹的活性中心结构关系、印迹分子的结构与酶活力的关系，寻找印迹酶高活力的理论基础则相当重要。,舀彻萨秒宜雕除庆刁沛匹屡沫般谤愁走颠格宗努毙瘴男凉勃牢晚肉臀针哮第六章人工酶第六章人工酶,人工模拟酶的研究属于化学、生物学等领域的交叉点，属交叉学科。综合运用化学、分予生物学和遗传学知识会大大加强人工催化剂设计方法的威力和可用性，从而产生医药工业上有用的高效催化剂。,革命尚未成功，同志仍需努力！,揪移银羌遇肥做拢尚烘印姥志惨葱惕浆囤瑟尚碎秆患修瑰胰膜甭粤劣应纺第六章人工酶第六章人工酶,
