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1、,中心实验室 潘虹,遗传病研究与诊断方法简介,什么是遗传病（Inherited disease/hereditary disease）?,是指生殖细胞（精子和卵子）或受精卵的遗传物质，包括染色体和基因发生畸变或突变所引起的疾病特征 通常在上、下代之间按一定方式垂直传递 先天性疾病（不一定？）常有家族史 终身性,遗传病的主要分类,染色体病：细胞遗传学 基因病线粒体基因病体细胞遗传病？不同类型的遗传病遗传方式不同研究分析的方法不同,单基因病,多基因病,分子遗传学,细胞分子遗传学,染色体病,染色体的概念,染色体是细胞核内的基本物质，是基因的载体 染色体在细胞周期中以不同的形态存在从细胞间期到分裂中期
2、，持续经历凝缩和舒展的周期性变化在细胞分裂中期染色质通过多级螺旋化凝缩达到高峰，轮廓结构非常清楚，形成光镜看到的棒状小体,染色体病,由染色体异常或畸变引起表型异常（临床表现）称为染色体病 表型：多发畸形+智力低下+生长发育异常染色体异常 染色体畸变染色体病,数目异常,结构异常,染色体病的诊断方法,细胞遗传学（cytogenetics）：研究染色体的学科主要方法染色体核型分析技术（形态学）,描述染色体时常用几个概念,正常体细胞核内染色体是二倍体(diploid)，46,N女性：46,XX/男性46,XY倍体(ploidy)：把人精子和成熟卵子染色体数 23条定为一个染色体组，称作单倍体(hapl
3、oid)整倍体：染色体数是单倍体的整倍数，如69,92非整倍体：不是整倍体的染色体数目如45,47同源染色体：有丝分裂中期看到的大小、形态和结构相同一对染色体，一个来自父亲，一个来自母亲姐妹染色单体：由一个着丝粒连着的并行的两条染色单体,染色体分核型分析,染色体制备：细胞培养：血细胞37含细胞生长刺激因子PHA培养 6872h 加Colcemid使分裂细胞止于分裂中期 低渗膨胀细胞、收获细胞 固定：甲醇和冰醋酸将细胞固定在玻片上G显带：胰酶消化+Giemsa 染色核型分析：显微镜下阅片分辨率：分裂中期（500条带）510Mb,染色体畸变 数目异常,整倍体(euploid)：多倍体，如三倍体（6
4、9）、四倍体（92）等 多倍体是致死性的，罕见有三倍体的活产婴儿,染色体畸变 数目异常,非整倍体(aneuploid)：不是整倍体的染色体数目 超二倍体(hyperdiploid)，如三体(trisomy)或多体：是指某一对同源染色体多一条或更多活产婴儿中常染色体非嵌合状态的只有13、18、21三体综合征 亚二倍体(hyperdiploid)，如单体(monosomy)：某一对同源染色体丢一条能存活的单体：是X染色体单体,染色体畸变 结构异常,原因：断裂，/-异常重接，发生率非整倍体改变 结构重排分为：平衡改变：保留完整的染色体物质 非平衡改变：有染色体物质的丢失或/和获得常见类型：缺失、易位
5、、倒位、重复、插入、环形、双着丝粒和等臂染色体等 表型源于基因剂量的减少或增加,环染色体 ring chromosome,一条染色体二个末端发生断裂，断端相接呈环状一条染色体二个末端发生融合,染色体结构畸变 平衡易位,携带者本人表型正常生育产生18种配子受精胚胎发育出生、正常生长发育只有正常和平衡易位配子受孕异常染色体种类多，易发生流产、死胎、畸形儿出生等受精后遗传学效应取决于不平衡染色体片断的大小（基因数目和性质),小结,细胞遗传学研究染色体方法：染色体核型分析分辨率：510Mb染色体数目异常多于结构异常染色体结构畸变：平衡表型正常+遗传效应（生育影响）不平衡表型异常+生育影响,遗传病的主要
6、分类 基因组病,染色体重排累及了1几个Mb(reviewed in Lupski 1998)/微缺失或重复常规染色体核型(G显带)不能识别分子细胞遗传学(molecular cytogenetics)：主要应用基于原位杂交的有关技术分析基因组改变的学科,检测方法：分子细胞遗传学,主要方法基于原位杂交的有关技术（DNA片段+形态学），常用：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)光谱核型(spectral karyotyping,SKY)/M-FISH 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH
7、)/微阵列比较基因组杂交，arrayCGH,遗传病的检测方法,传统细胞遗传学方法（核型G显带）：分辨率510Mb分子细胞遗传学分析方法：FISH：探针不同分辨率有差别（测已知）缺失 1200kb（小缺失40kb）重复5001000kb SKY：分辨率12Mb aCGH：1M芯片分辨率 5kb 180kb芯片分辨率 30kb,FISH,是 20世纪80年代基于原位杂交技术发展起来的一项分子细胞遗传技术探针：荧光素标记各种人类DNA序列（重要工具）单拷贝序列 卫星和端粒 DNA 重复序列 PCR 扩增后的位点特异性DNA序列 BAC 或YAC 文库的长基因组序列 显微切割得到的染色体区带或臂的特异
8、序列 流式细胞仪分选染色体建立的DNA 文库,FISH,染色体FISH：探针与滴在玻璃片上的染色体DNA杂交间期核FISH：探针与固定的非分裂细胞间期核直接进行杂交 FISH 技术将染色体分析从细胞分裂中、早期扩展到间期细胞应用 基因定位和嵌合体克隆验证 确定染色体的微小缺失 染色体断点分析 间期细胞染色体异常的诊断(羊水、绒毛、卵裂球)间期细胞(组织标本)基因丢失(LOH)扩增或重排,FISH 结果判定,荧光显微镜下计数100个间期细胞核正常：90%以上的细胞显示正常信号类型异常：60%个以上出现异常信号类型,多色FISH和光谱染色体核型,M-FISH(multiplex-FISH)：利用5
9、种荧光素组合标记，在DAPI复染的背景下，使用一系列有精确发射光谱的滤光块，与成像系统结合形成24种特异的荧光图像(22条常染色体和2条性染色体)，使每一条染色体以不同颜色的荧光表现出来光谱染色体核型(spectral karyotyping,SKY)：利用五种光谱学不同的荧光素组合标记探针，与染色体杂交后通过独特的有专利技术的光谱干涉成像原理来捕获图像,什么是CGH？,Kallioniemi(1992)FISH基础上建立，主要用于肿瘤学研究 基本方法：2种荧光素标记待测和参照DNA等量混合 与滴中期染色体分裂相玻片原位杂交 荧光显微镜下采集染色体核型，计算机软件分析、测定分裂相中每条染色体的
10、荧光密度，根据二种荧光的比率计算待测和参照DNA的相对拷贝数,什么是 arrayCGH？,DNA探针固定在“玻片”上BACs/PACsOligo(5070bp)SNP目前Agilent 分辨率50kb含6万个探针,MLPA结果判定,相对峰域与对照相比减少35-50%判定缺失相对峰域与对照相比增加35-50%判定重复突变/多态性位于探针的连接点或与探针的连接点很近也可能导致相对峰域减少单一的外显子缺失需要其他方法证实,解决什么临床问题？染色体病/基因组病,表型异常 出生后：运动、智力发育障碍（智力低下）、生长落后、多发畸形、惊厥 出生前（宫内）：胎儿发育落后、畸形、羊水异常不明原因的流产、死胎的
11、胎儿实验室：染色体畸变的精确定位、判断异常片段分子大小局限性：染色体/基因组平衡性的改变不能检出,小结,分子细胞遗传学检测方法可以分辨5Mb的基因片段改变精确突变的染色体位点基因剂量的增减,单基因病,常用的几个名词,基因座：基因在染色体上的位置等位基因：同源染色体上同一基因座上二个基因之间的关系杂合子：一个个体的二个等位基因不同纯合子：一个个体二个等位基因相同半合子：只存在一个等位基因基因变异：基因组中任何核苷酸的改变,DNA多态性,等位基因存在二种或二种以上的形式，但对基因功能没有影响称为多态性多态性：群体中变异等位基因的频率1%DNA序列中1/100200bp就有一个多态性位点,单基因遗传
12、病分类,遵循孟德尔遗传规律传递的疾病常染色体遗传：致病基因位于染色体122 显性 隐性性染色体遗传：致病基因位于性染色体X/Y 显性 隐性 显、隐性是基于临床表型人为定义，实际上在细胞、生化、分子水平发生的变化不是一种绝对的区分,腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth Disease,CMT)，又称遗传性运动感觉神经病,高度临床和遗传异质性的周围神经病轻症：弓形足或神经传导速度减慢或无临床症重症：肢体远端肌无力和肌萎缩、马蹄内翻足和爪形足、肩胛腓骨肌萎缩型视神经萎缩型+共济失调患病率：1/2500遗传方式：常染色体显性 常染色体隐性 X连锁遗传,常染色体显性遗传的类型,完全显性：
13、纯合子和杂合子表型无差异不完全显性：杂合子表型介于纯合子和正常之间不规则显性：杂合子在不同条件下可以表现为显性或隐性（可能与致病基因表达程度有关），使传递不规律延迟显性 特别注意新生突变与常染色体隐性遗传的区别,基因检测技术,基于分子杂交Southern印迹杂交寡核苷酸探针杂交SNP芯片MLPAarrayCGHPCR-DNA测序,基于扩增片段的长度或有无STR连锁分析多重PCR检测缺失等位基因特异的PCRPCR-RFLP基于构象分析SSCP高效液相色谱（DHPLC）,临床分子遗传学基因突变分类,点突变 单个碱基突变：碱基转换/颠换同义、错义、无义突变 小的DNA序列变异：几个碱基插入、缺失、移
14、码、转录或启动子突变、剪接位点突变大片段突变：（数十数万个碱基）缺失、插入、重复和重排动态突变：特定短核苷酸序列（三核苷酸）拷贝数扩增,概念 非孟德尔遗传,遗传早现与动态突变表观遗传学和DNA甲基化基因组印记与单亲二倍体,非孟德尔遗传（一）遗传早现与动态突变,遗传早现(anticipation)：一些遗传病（常为常显）在代代传递中，发病年龄逐代提前、临表逐代加重静态突变(static mutation)：单基因病发生是由于某一基因与其调控序列中碱基突变，突变相对稳定动态突变(dynamic mutation)：1991发现分子机制 DNA序列中重复序列拷贝数扩增，重复单位 3-133bp 随世
15、代传递不断扩增拷贝数发病率和疾病严重性逐代升高和加重 迄今30种，主要神经肌肉系统遗传病,非孟德尔遗传（二）表观遗传和DNA甲基化,基因变异包含二大机制：DNA核苷酸序列改变（基因型改变）传递 DNA核苷酸序列不改变（基因型不改变），通过其他途径如碱基修饰 DNA甲基化基因表达变化传递表观遗传（epigenetic）：与经典孟德尔遗传机制交叉存在，共同促进基因变异和性状传递 可以自发出现与逆转 受环境与遗传因素共同影响与表观遗传相关：X-染色体失活和基因印记等,非孟德尔遗传（三）基因组印记与单亲二倍体,基因组印记（genetic imprinting）：个体的一对同源染色体或等位基因因为分别来
16、自父方和母方而出现表达差异有些基因只有父源表达，母源不表达；相反，有些母源表达，父源不表达 亲缘效应,基因印记,概念：个体的一对同源染色体或等位基因因为分别来自父方和母方而出现表达差异，形成不同的表型的现象有些基因只有父源表达，母源不表达；相反，有些母源表达，父源不表达 亲缘效应,单亲二倍体(uniparental disomy,UPD),一对同源染色体或一对同源染色体的某个区段全部来源于双亲的一方，或父方或母方的现象,基因组印记、单亲二倍体与遗传病,鉴定70 印记基因 除chr.12,18,19外，在大部分染色体发现有UPD，一般不影响表型 不被印记Beckwith-Wiedemann syndrome,BWS(chr.11p15 UPD mat)Silver Russell syndrome,SRS(chr.7p12-14/7q31-ter UPD pat)Prader-Willi syndrome,PWS(chr.15q11-13 UPD mat)Angelman syndrome,AS(chr.15q11-13 UPD pat)PWS,AS是最常见的与印记有关的遗传性疾病,多基因遗传,
