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1、中药材中金属汞、镉元素和两类（总有机磷、氨基甲酸酯）农药的残留量的快速检测方法研究中国药品生物制品检定所中药与民族药检验管理处杜庆鹏2010-03-03,由于中药的安全性已经严重阻碍中药的临床应用和发展。目前，我国已逐步制订完善了中药材和中成药中重金属元素和农药残留量的检测标准方法和限量标准。但在配合重大安全预警事件反应缺失、现场检测方面研究的涵盖面不够，需进一步深入系统地研究中药有害残留物快速检测方法。,简介,主要内容,一、中药材中汞快速检测试纸方法研究（纸片法）二、中药材中镉快速检测试纸方法研究（纸片法）三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留 快速测定方法（速测卡）,一、中药材中重金属
2、汞的快速检测方法研究,汞是毒性最强的元素之一，是中药材中重要的金属污染物之一，汞被人体吸收后主要损害肾脏，造成肾功能衰竭。中药材中汞严重超标的问题时有报道。鉴于中药的安全性已经严重阻碍中药的临床应用和发展，以及中药材具有与食品和环境样品不同的特性，因此进一步深入系统地研究中药有害残留物快速检测方法已经刻不容缓且十分必要。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,方法原理 在酸性条件下，显色剂二苯碳酰二肼（DPC）与Hg2+发生络合反应，生成紫红色络合物（520nm），检测试纸由白色变为紫红色，颜色的深浅与Hg2+的含量成正比。仪器与试剂,二苯碳酰二肼；乳化剂OP；缓冲溶液：pH9.0 的硼砂-
3、NaOH缓冲体系；分析用定量滤纸,图1 自制反应装置A-为100ml标准锥形瓶；B-带弯口中空的标准磨口塞，上连弯口的乳胶导气管C；D-为玻璃口；E-带刻度玻璃管或者塑料管。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,试纸制作 取10ml 0.5%二苯碳酰二肼乙醇溶液，加入2 ml 12%乳化剂OP；将定量分析用滤纸剪成0.6 cm宽的试纸条，用上述溶液充分浸泡后自然晾干，备用。使用时，剪成0.60.8cm试纸片。试纸使用方法 取3.0ml待测样品，加入1.0ml缓冲溶液；从试纸瓶中快速取出一条汞检测试纸浸入上述样品溶液中，20秒后取出；检视，与对照颜色比较，即可对样品中汞含量进行定性或定量检测
4、。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,标准色阶 分别取系列浓度标准溶液3ml置10ml刻度试管中，加1ml pH=9.0 的硼酸-氯化钾缓冲液，混匀，用1NaOH溶液调节pH值至5.0左右，取试纸片置于上述溶液中浸泡片刻，取出检视。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,样品溶液的制备 取中药材粉碎，取约2g于50ml锥形瓶中，加20 ml 3%HCl，振摇10min，迅速投入1g产气剂（硼氢化钠：无水硫酸钠=1：19），将气体导入（约为pH=3）的吸收液（配制方法：取 0.450.5 ml硝酸用水稀释至1000ml），反应完全后，用1NaOH溶液调节pH值至5.1左右，即可。（同时作
5、试剂空白）测定 在上述吸收液中，加入1 ml pH=9.0 的硼酸-氯化钾缓冲液，混匀，静置，取试纸片置于溶液中浸泡片刻，取出检视。（试纸片固定在白色底物片上，以便检视）。*完成一次 检验周期仅耗时2030分钟,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,条件优化反应酸度的选择 试验中遇到试纸本底颜色变化较大严重影响颜色判断的问题，经查找原因发现酸度的强弱影响试纸本底的颜色，干扰实验结果的检视。为了减少这种本底显色的干扰，对在不同的酸度条件下试纸本底的显色进行了研究，经优化选择在pH=5.0的酸性条件下本底显色最浅，对实验的干扰会最小。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,表面活性剂的选择 由
6、于在纸层析实验中易出现扩散，影响结果。本实验采用加入一定量表面活性剂，使待测体系的稳定性增加并且能减小颜色扩散程度，因此实验中分别比较了10%、12%、15%的OP乳化剂含量时试纸的显色以及色阶的情况。12%和15%的色阶明显好于10%，而12%和15%结果差别不大，因此试验采取加入2ml 12%的乳化剂OP量。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,纸片显色时间及络合物的稳定性 纸片浸泡片刻后，将试纸片取出放置到白色PV底板上在030分钟内观察颜色的变化。随着试纸暴露在空气中时间的延长，显色越深，色阶越不明显。因此最佳的观察时间应该在试纸取出之后，待残留在白板上的液体挥发完全而试纸表面仍旧
7、保持湿润的情况下检视（观察）。具体观察的时间可以根据此标准具体情况具体掌握。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,滤纸的选择 固定显色剂（0.5%）和OP（12%）的量，分别采用定量中速、慢速滤纸制作试纸片。从显色情况来看，中速滤纸的显色效果不太均匀，而且颜色扩散现象严重，而慢速滤纸显色均匀，并且使不同浓度（0.1、1、10g/ml）的色阶更加明显，故选用慢速滤纸作为显色剂的载体。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,样品提取酸液的酸度选择 分别采取1%、3%、5%的盐酸进行提取试验，发现3%的盐酸空白本底干扰较小，而且与起泡剂的反应速度适中，因此选择3%的盐酸作为提取样品溶液,一、中
8、药材中重金属汞的快速检测方法研究,回收试验 取中药材黄芪粗粉约2.0g置于50ml锥形瓶，加20 ml 3%HCl，分别添加汞1、10g/ml对照品溶液，振摇10min，按上述方法操作,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,产气剂的回收效率 对3ml含汞（5g/ml）的标准液，按标准方法产气得3毫升吸收液（回收液），与标准的吸收液3ml（含汞浓度5g/ml、对照溶液）相比较。从图看略有差异。说明该操作方法下，溶液转换较为完全。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,样品考察 根据中药的茎、根、叶、花、果等分类，选取了有代表性的几十种中药材综合考察本方法的可行性。取中药材银杏叶、甘草、黄芪、
9、金银花、红花、菊花、杜仲、火麻仁、皂角刺、白芍、前胡、车前草、等几十种中药材，结果均未达到3g/ml（ppm）。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,结果与讨论*目前已经市场化的汞快速测定的方法，比如北京一家公司所生产的铜片法快速测定汞含量。我们将铜片法与我们的实验方法进行了比较实验，发现，铜片法只有当汞的含量大于20g/ml时铜片表面才会出现银灰色，而且现象不明显，不太好判断，此方法灵敏度较低，而且实验费时，费力，不方便现场操作，而我们的方法灵敏度较高（3g/ml），并且实验时间短，易操作，不需要加热，适用于现场操作，为中药材中重金属汞的现场质量控制提供了比较好的方法依据。,方法验证 浓
10、度为1g/ml的汞标准溶液加产气剂，按标准方法产气得吸收液，用原子荧光法进行测定，结果吸收液汞含量为1.01g/ml，同时进行试纸法测定，结果表明该溶液汞含量为1g/ml左右。产气后的溶液残留汞含量为0.012g/ml，试纸法测定结果为空白色。结果说明：（1）产气剂反应较完全，（2）试纸法测定结果与仪器分析法检验结果基本一致。,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,一、中药材中重金属汞的快速检测方法研究,结果与讨论*显色剂使用过程中要避光。*制作好的试纸要避光保存，现用现取，不可置于空气中过长时间。*由于试纸片颜色变化为樱红色到紫红色，两种颜色干扰较大，基于肉眼观察的基础，我们认为当最低检出
11、浓度为3g/ml时人眼观察比较明显，误判的几率会大大减少，而且比较时最好同时做一随行对照，并且最好使用同一批次的纸片。*有条件的情况下可以将产气剂压成片子，直接使用，既携带方便又减少了称量过程，同时还保证产气反应相对持久。*处理样品时采用投入产气剂的方式，操作简单，样品的颜色等因素不会干扰实验现象，并且不会引入其他的干扰离子。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,*镉主要用于金属电镀，还可用于制造体积小和电容量大的电池。在目前自然界中污染已经较为严重。机体中摄入一定的镉可造成急、慢性中毒，并且具有较强的致癌危险性。由于其毒性的原因，现在已经越来越被大众所关注。,二、中药材中重金属镉的快速检
12、测方法研究,方法原理 在碱性条件下，镉试剂与Cd2+反应生成橘红色络合物（330nm），颜色的深浅与Cd2+的含量成正比，通过颜色的深浅就可以确定镉的浓度。仪器和试剂镉试剂 氢氧化钾 乙醇；定量滤纸；0.1%镉试剂的氢氧化钾乙醇溶液（取0.1克镉试剂，加0.125mol/L氢氧化钾乙醇溶液，溶解，并稀释至100mL）,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,试纸制作方法 配置0.1%镉试剂的氢氧化钾乙醇溶液，将定量分析用滤纸剪成0.6cm宽的试纸条，充分浸泡后自然晾干，备用。使用时，剪成0.60.8cm试纸片。试纸使用方法 取10 ml待测样品，置15ml刻度试管中，用氢氧化钾（10mol/l
13、）调节（约67滴）pH值约为7.0，从试纸瓶中快速取出一条镉检测试纸浸入上述样品溶液中，5秒后取出，检视。与标准色阶比较，即可对样品中镉含量进行定性或半定量检测。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,标准系列色阶的制备 取镉标准储备液（100g/ml）适量，分别加3%HNO3稀释并配制成0.0、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0g/ml Cd2+标准系列溶液，检验。,测定步骤*取中药材粉碎（粗粉）或者剪成小碎片，取约2g精密称定于50mL锥形瓶中，加20 mL 3%HCl，振摇5 min，静置。（同时作试剂空白）*取上清液10mL和试剂空白液按上述方法进行测定，之后与标准色阶
14、或者随行对照溶液颜色比较。*完成一次检验周期耗时仅为1520分钟,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,条件优化：滤纸的选择 同法分别用中速、慢速滤纸制作试纸，与0g/ml、0.1g/ml、0.5g/ml、1.0g/ml、3.0g/ml、5.0g/ml、10.0g/ml Cd2+标准溶液与镉试剂反应。,从显色情况来看，慢速滤纸的显色效果较好，而且使不同浓度的色阶更加明显，故选用慢速滤纸作为显色剂的载体。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,纸片浸入反应时间的选择 同时将六片试纸片浸于5.0g/ml Cd2+溶液中，分别在5s、10s、20s，30s，40s，50s后取出观察颜色深浅 由试
15、验可知，镉与镉试剂的反应是迅速的，因此只要纸片在溶液中浸透以保证显色均匀即可，我们选择了5s的反应时间。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,纸片取出最佳检视时间的选择 将纸片从溶液中取出后置于白色底板上，记录放置不同时间后颜色的变化及色阶情况，实验所用镉标准溶液浓度分别为1.0g/ml、3.0g/ml、5.0g/ml、10.0g/ml。最佳观察时间应该在210min时观察，为节省实验时间我们选择了放置2min时观察颜色。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,加标回收实验考察 称取芦根样品1.5g，平行三份，剪成小碎片，置50或100ml锥形瓶中，各加3%的盐酸溶液15ml，实验分别加
16、入0.15、0.45ml的（100g/ml）的镉对照品溶液，振摇510min，取上清液10ml，用氢氧化钾调节pH值为7.0左右。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研究,样品测定 根据中药的茎、根、叶、花、果等分类，选取了有代表性的几十种中药材综合考察本方法的可行性。如黄芪、甘草、柴胡、芦根、乌药、白芍、白芷、麦冬、桑寄生、土木香、川木香、杜仲、肉桂、陈皮、红花、金银花、菊花、野菊花、银杏叶等50余种。按上述方法制备供试液，检测。所有参与实验的中药材检测结果都未含有镉元素，显色都与空白接近，只有八角、茴香的显色比空白深，但是浅于对照的颜色（1g/ml）。,二、中药材中重金属镉的快速检测方法研
17、究,结果与讨论 1.镉试纸颜色变化由空白的黄色，转为橘红色，浓度太低时，肉眼不太好分辨，考虑到本实验目的是快速筛选，因此我们认为本法的最低检出浓度为0.5g/ml时即可满足实验要求。2.本试纸片贮藏进行了-34、室温、50，16个月的考察。结果表明，该试纸在六个月内均可保证有效。3.通过对几十种中药材中Cd2+含量测定的研究，认为本方法是可行的。个别药材如金银花，红花等样品，建议药材不要粉碎过细或者提取时间过长，提取之后马上测定，防止色素影响结果的检视。4.本研究研制出的镉试纸主属性较强，方法操作简便快速、灵敏、携带方便，是一种比较理想的检测试纸，可以用于定性和半定量分析。,三、中药材中有机磷
18、及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,随着近年来人民生活水品的日益提高，人们对农药残留的关注程度是与日俱增。虽然在这方面国家已经颁布了众多的政策法规来规范农药的使用，出台了各类农药残留检测标准来进行监管，同时检验仪器的推陈出新不断提高农残检测技术的灵敏度。但是在现场监控方面还有着许多的不足。我们之所以选择有机磷类和氨基甲酸酯类农药作为检验的方向。是因为上述两种农药现今适用范围广；毒性大；且属于急性中毒性反应。,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,方法原理：胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变
19、色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。试剂及试药 固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（速测卡）；磷酸氢二钠；无水磷酸二氢钾；乙酸乙酯；pH 7.5磷酸氢二钠缓冲溶液；PR-3测定仪,下面将分有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药两个方面进行说明,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,对照溶液的考察 以对硫磷为代表进行实验。用缓冲溶液依次稀释即得,（一）有机磷类农药,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,供试品溶液制备 第一法 取中药材样品适量，捣碎成粗粉称取1.0g放入带盖塞瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇，静置片刻，取
20、上清液备用（适用于一般样品）。第二法 取中药材样品适量，捣碎成粗粉，称取1.0g样品放入带盖瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，超声3 分钟，静置，取上清液过活性炭小柱，取滤液2 mL于50水浴蒸至近干，加1mL缓冲溶液溶解，备用（适用于色素含量较高的样品）。,（一）有机磷类农药,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,测定 取一片速测卡，在白色药片上滴23滴供试品溶液，放置10 min进行预反应，（有条件时在372恒温装置中放置10 min，预反应后的反应表面必须保持湿润）然后将速测卡对折，用手捏3 min（或用恒温装置恒温3 min），使红色药片与白色药片叠合发生反应。之后观察白
21、色药片的颜色变化。注：每批次测定应设一个缓冲溶液的空白对照卡。完成一次检验周期耗时仅为2030分钟,（一）有机磷类农药,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,中药材中添加农药的回收试验的考察*取麦冬粗粉样品数份，并按某一系列浓度对样品进行对照品添加。按第一法制备,（一）有机磷类农药,*取红花粗粉数份，并按某一系列浓度对样品进行对照品添加。按第 二法制备。,对照溶液的情况考察 称取对照品抗蚜威5mg和克百威5mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。总氨基甲酸酯类农药浓度为100g/mL。,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,（二）氨基甲酸酯类农药,
22、三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,供试品溶液配制及测定，同前文有机磷测定中药材中添加农药的回收情况考察 取麦冬粗粉样品数份，并按某一系列浓度对样品进行对照品添加。按第一法制备,（二）氨基甲酸酯类农药,取银杏叶粗粉数份，并按某一系列浓度对样品进行对照品添加。按第二法制备。,三、中药材中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留快速测定方法,样品测定 根据中药的茎、根、叶、花、果等分类，选取了有代表性的几十种中药材进行实验。如黄芪、红花、金银花、银杏叶等。按方法一、二法制备供试液，测定。结果 所有参与实验的中药材检测结果都呈阴性，未检出有机磷或者氨基甲酸酯类农药,三、中药材中有机磷及氨基
23、甲酸酯类农药的残留快速测定方法,结果与讨论*每批测定应设一个洗脱液的随行空白对照卡，只有在相同的条件操作，方可以消除影响因素，才有可比性，使其实验结果得到准确判定。*如果选取小碎块状样品或者整株样品，采用缓冲溶液直接振摇提取，往往色素干扰不明显，因此一般药材现场测定建议采用一法。*如果药材中的色素量大，严重干扰试验结果的判定，则可以采用乙酸乙酯提取法。现场测定时建议采用第二法进行提取测定。*实验测定中设置10 min预反应时，如果在较干燥的环境下实验，则应该保持试纸表面湿润。当温度低于37时，则应当适当延长反应时间。,本套快检方法，经由吉林市药品检验所复核。应用于药品检验车（快检车）上，快检车运行620公里，覆盖3个县，6个乡镇，18个药材经营单位，1个药材种植基地，检验药材93批次，共检出阳性样品3批次。结论为“本方法检测灵敏、准确、稳定，方法简便、适用、可做为限量检查的初筛方法及重大事件的快速筛查。”,总结,总结,中药材中的重金属、农药残留的检测方法比较,谢谢大家,
