《siRNAsurvivin 与 p53 共表达质粒的构建及对前列腺.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《siRNAsurvivin 与 p53 共表达质粒的构建及对前列腺.doc（8页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、精品论文大集合siRNA-survivin 与 p53 共表达质粒的构建及对前列腺癌细胞生长的影响1邵月婷 1，邵晨 1，刘亚男 1，李晓洁 1，汲坤 1，张灵 1，赵丹 1，孙连坤 1，赵雪 俭 1，徐德启 2，胡嘉弟 3， 李扬 11 吉林大学白求恩医学院病理生理教研室，长春（130021）2 美国食品与药品管理局，Bethesda (20892)3 美国马里兰大学医学院，Baltimore (21201)E-mail: lyang摘要：目的：构建 siRNA-survivin 与 p53 共表达质粒，观察共表达质粒对前列腺癌 PC-3细胞生长的影响。方法：免疫组织化学染色检测前列腺癌组织
2、 survivin 与 p53 的表达；基因 克隆技术构建 siRNA-survivin 与 p53 共表达质粒；PCR 检测转染细胞 survivin 与 p53 mRNA表达；MTT 及流式细胞术检测转染细胞增殖和细胞周期变化。结果：免疫组织化学结果显示，前列腺癌组织中 mt-p53 及 survivin 蛋白表达显著高于正常前列腺组织(P0.001)，两者 表达水平存在正相关(rs0.514，P0.020)。经酶切及测序鉴定，成功构建了含双启动子、可同时高效表达 siRNA-survivin 和 wt-p53 蛋白的共表达质粒 Psp53。PCR 结果表明，Psp53组 p53 mRNA
3、 表达增强，survivin mRNA 表达减弱(P0.01)。MTT 结果显示，Psp53 组与单 独质粒应用组比较细胞生长抑制作用明显增强(P0.05)。与 p53，si-survivin 单独应用组比较，Psp53 组 G1 期阻滞更明显，S 期细胞所占百分比仅为 12.71.33（P0.01）。结论：成功构建 siRNA-survivin 与 p53 共表达质粒，该质粒具有协同抑制前列腺癌 PC-3 细胞生长的作用。 关键词：p53 基因，survivin 基因，前列腺癌，RNA 干涉前列腺癌是欧美男性最常见的恶性肿瘤。2008 年估计约有新发病例 186，320 人1。肿 瘤基因治疗
4、是生物学治疗的热点，但目前治疗效果并不理想，为寻求更好的治疗方案以加强 疗效，本文通过构建共表达 p53 蛋白及短发夹状 siRNA-survivin 的重组真核质粒，初步探讨 wt-p53 蛋白联合 RNAi 技术沉默 survivin 在体外对激素非依赖性前列腺癌的作用，以期为前 列腺癌的基因治疗提供新的理念和治疗策略。1材料和方法1.1 材料T4 DNA 连接酶及各种内切酶为 Takara 公司产品；Oligod(T)，MML-V 逆转录酶，Taq 酶及 DNA 凝胶回收试剂盒为 Fermentas 公司产品；引物合成由上海生工生物工程技术服务 有限公司完成；Lipofectamine
5、TM2000 及 Trizol 为美国 Invitrogen 公司产品；带有 U6 启动子 及 GFP 的质粒 pGCsilencer-U6/Neo/GFP 购自上海吉凯化学公司，全长 6380bp；pMD-18T vector，全长 2692bp，购自 Takara 公司；克隆有野生型 p53(wt-p53)基因的 pQE40-p53 质粒， pcDNA3.1 表达载体及大肠杆菌 JM109，人激素非依赖性前列腺癌 PC-3 细胞株，本室保存。 正常前列腺组织及前列腺癌组织为内蒙古民族大学第二附属医院病理科和吉林大学前列腺 疾病防治研究中心提供。1 本课题得到教育部博士学科专项基金的资助（2
6、0070183012 减毒沙门氏菌靶向携带共表达 p53 和 siRNA-survivin 质粒抗前列腺癌的实验研究）。- 8 -1.2 方法1.2.1 survivin, p53 在正常前列腺及前列腺癌组织的免疫组织化学染色16 例正常前列腺组织、20 例前列腺癌组织(组织切片均经病理证实)。常规进行免疫组 织化学染色，一抗分别为 survivin 兔抗人多克隆抗体和 p53 鼠抗人单克隆抗体。对照：选用己知染色阳性的乳腺癌组织作阳性对照，以 PBS 代替一抗作阴性对照。 结果判断标准：以 p53 和 survivin 蛋白在细胞胞核、胞浆内是否出现棕黄色颗粒或染色分为(+)和(-)。1.2
7、.2 siRNA-survivin 及 p53 真核共表达质粒的构建及鉴定以 pQE40-p53 质粒为模板，根据人 p53 的 cDNA 序列设计、合成引物 P1 和 P2，并在 其上下游分别引入 KpnI 和 EcoRI 酶切位点（下划线），在起始密码子 ATG 之前加入 Kozak 序列 GCCACC，PCR 方法扩增出 p53 全长 1182bp，克隆至真核表达载体 pcDNA3.1 中，构 建 pcDNA3.1-p53 质粒。参照 pcDNA3.1 及 pGCsiRNA-survivin( 本研究室前期合成， NM001168，靶位点 394412，携带 GFP)质粒图谱设计引物 P
8、3 和 P4，在其上下游分别引 入 Bgl II和 Nru I酶切位点（下划线），长度为 585bp。应用 PCR 方法扩增出 U6 启动子及 siRNA-survivin 序列，并克隆至 pcDNA3.1-p53 质粒中，经菌液 PCR 初筛，测序并酶切鉴定 可同时表达 siRNA-survivin 和 p53 基因的 pcDNA3.1-U6-si-survivin/p53 质粒。P1：5GGGGTACC（GCCACC）ATGGAGGAGCCGCAGTCAG3；P2：5GGAATTCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG3 P3：5GCAGATCTTGCTTCGCGATGTACGGG
9、CC3 P4：5GCAGATCTTGCTTCGCGATGTACGGGCC31.2.3 重组质粒转染前列腺癌 PC-3 细胞以去内毒素质粒提取试剂盒提取 pcDNA3.1-p53 质粒（以下略称为 p53），pGCsiRNA-survivin 质粒（以下略称为 si-survivin），pcDNA3.1-U6-si-survivin/p53 质粒（以下略称为 Psp53）及 siRNA-scramble 质粒（以下略称为 si-scramble），并以 DNA 定量。PC-3 细胞在无抗生素（含10%新生牛血清）的 IMDM 培养基，37，5%CO2 条件下培养。当贴壁细胞达 90%-95%融
10、合时，按 Lipofectamine TM2000 说明书进行操作，转染后分别于 48h 和 72h 收集细胞备用。1.2.4 荧光显微镜、流式细胞仪观察并检测转染效率分别取 mock（脂质体对照）组，si-survivin 组和 si-scramble 组的 PC-3 细胞，其中构建 的 si-survivin 质粒及阴性序列载体 si-scramble 携带绿色荧光蛋白（GFP），可以此质粒作为 报告基因，通过荧光显微镜直接观察拍照。每次转染均以此报告基因经荧光显微镜观察，以 保证转染效率。同时，以 0.25胰酶消化携有 GFP 组细胞，PBS 洗 2 次，调整细胞浓度为1106/ml，用
11、流式细胞仪检测荧光细胞比例，判定转染效果。1.2.5 PCR 检测转染细胞 survivin 及 p53 mRNA 表达遵循 PCR 引物设计原则，根据 GeneBank 人 survivin 基因、p53 基因 cDNA 序列，分别 设计引物。其序列如下:survivins e n s e ：5-GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC-3(475bp)a n t i s e n s e ： 5-AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC-3p53s e n s e ：5-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3 (259bp)a n t i s e n s e
12、： 5-CACAAACACGCACCTCAAA-3PCR 扩增条件：94预变性 5min， 94变性 30s，56- 59退火 30s，72延伸 45s，30 个循环，最后 72延伸 5min。扩增产物以 1%琼脂糖凝胶电泳，通过 GIS 凝胶成像系统分析电泳条带光密度值，以目的基因与内参 GAPDH 比值确定其含量。1.2.6 细胞增殖抑制实验（MTT 比色法）取对数生长期 PC-3 细胞接种于 96 孔培养板，细胞密度为 5104cell/ml，每孔 180l。分 为 mock 组、p53 组、si-survivin 组、Psp53 组及 si-scramble 组，每组 5 复孔。设 4
13、8h、72h 两个时间点。细胞培养至第 44h 和 68h，分别在相差显微镜下观察拍照后，每孔加入 MTT（5g/L，PBS 新鲜配制）20l，继续孵育 4h，吸弃培养液，每孔加入 DMSO100l，震荡 10min， 酶标仪检测各孔吸光度值（OD570），计算细胞增殖率。实验重复 3 次。细胞增殖率（%）=（实验组/对照组）100%1.2.7 流式细胞术（Flow cytometry, FCM）检测细胞周期收集转染 72h 后的各组 PC-3 细胞，1000rpm 离心 10min，冷 PBS 洗 2 次，弃上清，将 细胞用 1ml 注射器快速推入 70%冷乙醇中，4固定 12h 以上。PB
14、S 洗 2 次，调整细胞浓度 为 1106/ml，用 RNase A 消化后，加入 1.5ml PI（5mg/100ml），混匀后上流式细胞仪做单 参数分析。1.3 统计分析数据以 x s 表示，采用 SPSS14.0 统计软件进行 Chi-Square Tests, Spearman 相关分析和 方差分析，P0.05 作为差异显著的判断标准，应用 Excel 作图。2结果(1) survivin 与 p53 在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的表达 正常前列腺组织可见腺体基底细胞连续，基底膜完整，survivin，mt-p53 蛋白染色阴性或仅有少数标本有微弱表达；前列腺癌组织中 mt-p53
15、 和 survivin 蛋白呈强阳性表达。survivin 蛋白阳性产物主要定位于细胞质中，也有少量分布于胞核，而 p53 蛋白阳性产物主要定位于 细胞核中(图 1)。前列腺癌组织 survivin 蛋白阳性表达率为 85%，mt-p53 蛋白阳性表达率为60%，与正常前列腺组织比较，P0.001。经 Spearman 相关分析，前列腺癌组织 survivin 与mt-p53 蛋白表达存在正相关，rs0.514，P0.020。p53 expression in normal prostatep53 expression in prostate tumorsurvivin expression
16、in normal prostatesurvivin expression in prostate tumor图 1 正常前列腺组织、前列腺癌组织 p53 和 surviving 表达的免疫组织化学分析Fig. 1 Immunohistochemical analysis of p53 and survivin expression in normal prostatic tissue and prostatic cancer tissue (200)(2) Psp53 重组质粒酶切鉴定、测序结果如图 2 所示，经 PCR 获得人 p53（图 2，A）和带有 U6 启动子的 siRNA-sur
17、vivin 片段（图 2，B）。将两个片段与真核表达载体 pcDNA3.1 连接，以 Bgl II 和 Nru I双酶切，释放 出大小为 536bp 片段，与 U6/siRNA-survivin 序列大小一致。同时将该重组质粒以 KpnI 和 EcoRI 作双酶切，释放出大小为 1182bp 片段，与 wt-p53 全长相符（图 2，C）。经测序鉴定 正确（测序图略）。成功构建 p53/si-survivin 共表达质粒(Psp53)。M2M1 123 M2ABC1000b500bp图 2 琼脂糖凝胶电泳鉴定 p53/si-survivin 重组质粒Fig.2 Agarose gel elec
18、trophoresis analysis of recombinant plasmid p53/si-survivinA. PCR product of p53 from pQE40-p53 plasmid B. PCR product of si-survivin from pGCsi-survivin plasmidC. Identification of p53/si-survivin by enzyme digestionM1:DL15000 marker; M2: DL2000 marker; Lane 1: p53/si-survivin plasmid; Lane 2: Dige
19、stion of p53/si-survivin recombinant plasmid with KpnI and EcoRI; Lane 3: Digestion of p53/si-survivin recombinant plasmid with Bgl II and NruI(3) 荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率构建的 si-scramble，si-survivin 重组质粒均携带绿色荧光蛋白基因，转入 PC-3 细胞后表 达绿色荧光蛋白。si-survivin 组在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，而 mock 组未见绿色荧 光，见图 3A, B。应用流式细胞仪测定 mock 组平
20、均转染效率为 2.1，si-survivin 组为 61.4(图 3C, D)ABCD图 3 荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率Fig.3 Transfection efficiency determined by fluorescence microscope and FCM analysis (n=3)A. mock group; B. transfection with siRNA-survivin plasmid; C. transfection efficiency of mock group detected by FCM; D. transfection efficiency o
21、f siRNA-survivin plasmid group detected by FCM(4) p53,survivin mRNA 表达半定量 RT-PCR 检测结果如图 4，与 mock 组，si-scramble 组比较，p53 组、si-survivin组以及 Psp53 组 p53 mRNA 表达增强，survivin mRNA 表达减弱(P0.01)。M12345p53 survivinGAPDH1.210.80.60.40.20mockp53si-survivinPsp53si-scramble* * * *p53survivin图 4 转染重组质粒的 PC-3 细胞 p53,
22、 survivin mRNA 表达Fig.4 RT-PCR analysis of p53, survivin mRNA in PC-3 cells transfected with recombinant plasmidsM: DL2000 marker; Lane 1: mock group; Lane 2: p53 group; Lane 3: si-survivin group; Lane 4: Psp53 group; Lane 5: si-scramble group （*P0.01 vs mock and si-scramble group）(5) 细胞增殖抑制实验结果MTT 比
23、色法检测重组质粒转染 48h 及 72h 后各组细胞的增殖能力，以 mock 组的生存 率作为 100%。结果显示，转染 48h 后，p53，si-survivin，Psp53 三组 PC-3 细胞增殖率分别 为 58.5%，56.8%和 40.3%，72h 细胞增殖率分别为 42%，43.5%和 26.4%。与两对照组相比， 差异具有显著性(P0.05, P0.01)。共表达质粒 Psp53 组与单独质粒应用组比较抑制作用明显 增强(P0.05)，显示了两抗肿瘤因子的协同作用。重组质粒转染 72h 抑制细胞增殖效果优于48h(图 5)。120mockp53si-survivinPsp53si
24、-scramble10080*60*#growth rate(%)4020* *0*#48h72h图 5 MTT 法检测各组质粒转染后 PC-3 细胞的生长Fig.5 Growth inhibitory effect for PC-3 cells transfected with p53, si-survivin, Psp53 plasmid (*P0.05,*P0.01 vs mock, si-scramble groups; #P0.05 vs p53, si-survivin groups)(6) 流式细胞术检测细胞周期与两对照组相比，各实验组细胞于转染重组质粒 72h 后出现细胞周期
25、G1 期阻滞(P0.01， 见图 6，表 1)。与 p53，si-survivin 单独应用组比较，Psp53 共表达质粒组 G1 期阻滞更明显， S 期细胞所占百分比仅为 12.71.33（P0.01）。si-scramblep53si-survivinPsp53图 6 PC-3 细胞转染重组质粒 72 小时后流式细胞仪细胞周期分析结果Fig.6 FCM analysis for PC-3 cells transfected with recombinant plasmids after 72 hours表 1 PC-3 细胞转染重组质粒后细胞周期分析Table 1 Cell cycle a
26、nalysis in PC-3 cellsGroup(n=3)mock p53si-survivinPsp53si-scrambleG0-G1(%, meanSD)26.41.3544.31.17*46.91.53*55.91.76*27.32.05G2(%, meanSD)34.50.3320.41.00*18.30.71*31.40.8135.01.18S(%, meanSD)39.01.8535.70.4434.82.2612.71.33*#39.35.00(*P0.01 vs mock, si-scramble groups; #P0.01 vs p53 and si-survivin
27、 groups)3讨 论p53 基因系公认的抑癌基因，近一半的前列腺癌组织中突变型 p53(mt-p53)表达阳性。p53 的突变或缺失与前列腺癌浸润、转移和预后密切相关2。尽管大多数肿瘤存在 p53 失活突变， 但仍有近 40肿瘤保持着 wt-p53，这部分肿瘤可能还存在其它基因的突变3。这些限制了 wt-p53 基因治疗的疗效。因此，深入探讨 wt-p53 基因治疗肿瘤的机理，寻找 wt-p53 联合其 它基因或手段抗肿瘤成为必然。survivin 是 1997 年发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族的一个 新成员4。有研究发
28、现, survivin 基因在前列腺癌、前列腺组织中的再激活和异常表达而导致 的细胞凋亡抑制参与了前列腺癌的发生、发展。survivin 蛋白表达和前列腺癌细胞凋亡呈负 相关5。由于 survivin 在肿瘤组织高表达，正常组织不表达的特性，适宜应用 RNA 干涉(RNA interference)技术。我们的前期工作表明，siRNA-survivin 可以显著下调 survivin 基因的表达， 通过诱导细胞凋亡发挥抗前列腺癌作用。但是在哺乳动物细胞中，对于异常高表达的基因 RNAi 并不能完全阻断其表达6 。本研究通过联合基因治疗手段，在对 survivin 进行 RNA 沉默的基础上，增
29、加了 wt-p53 基因的再表达，试图从不同途径抑制肿瘤细胞增殖，以期获 得协同放大的抗前列腺癌效应。我们首次将表达野生型 p53 的基因与人 U6 启动子介导的 survivin siRNA 表达框架构建 在同一载体上，构建出可同时表达 p53 和 siRNA-survivin 的共表达质粒 Psp53。半定量 RT-PCR 结果显示，转染 siRNA-survivin 及 Psp53 质粒组 survivin 表达明显降低，而 p53 组 survivin 的表达与对照组比较也呈降低趋势。提示除小干扰 RNA 引起的 survivin 沉默， wt-p53 在细胞中过表达可抑制 survi
30、vin 活性。MTT 检测结果表明 p53， siRNA-survivn 及 Psp53 转染组均可抑制 PC-3 细胞增殖。与 两对照组相比，差异具有显著性(P0.05,P0.01)；共表达质粒组与单独应用组比较抑制作用 明显增强(P0.05)。通过流式细胞术检测细胞周期，发现 p53，siRNA-survivn 两者合用，G0/G1 期阻滞达 55.9，G2 期阻滞在 31.4，S 期 12.7，与 MTT 结果相吻合。本研究在得出 mt-p53 与 survivin 在前列腺癌中表达正相关的前提下，成功构建 p53 和 siRNA-survivin 的共表达质粒，通过基因转染获得高表达
31、wt-p53 蛋白和沉默 survivin 的共表 达细胞模型，并显示了对激素非依赖性前列腺癌细胞生长的抑制作用，作为一种新的基因治 疗方法有较好的发展前景。参考文献1 Cancer Facts & Figures 2008 http:/www.cancer.org.2 Oxley JD, Winkler MH, Parry K, et al. p53 and bcl-2 immunohistochemistry in preoperative biopsies as predictors of biochemical recurrence after radical prostatectom
32、y J. BJU Int, 2002, 89(1): 27-32.3 Zeimet AG, Riha K, Berger J, et al. New insights into p53 regulation and gene therapy for cancer J. BiochemPharmacol, 2000, 60 (8):1153-1163.4 Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med, 1997,
33、3(8):917-921.5 Esteve PO, Chin HG, Pradhan S. Molecular mechanisms of transactivation and doxorubicin-mediatedrepression of survivin gene in cancer cells J. Biol Chem, 2007, 282(4): 2615-2625.6 Pai SI, Lin YY, Macaes B, et al. Prospects of RNA interference therapy for cancer J. Gene Ther, 2006, 13 (
34、6):464-477.Construction of co-expressed siRNA-survivin and p53 vector and effects on proliferation activity of human prostate cancer cellYueting Shao1, Chen Shao1, Yanan Liu1, Xiaojie Li1, Kun Ji1, Ling Zhang1, DanZhao1, Liankun Sun1, Xuejian Zhao1, Deqi Xu2, Jiadi Hu3, Yang Li11 Dept. of Pathophysi
35、ology of Norman Bethune College of Medicine, Prostate DiseasesPrevention and Treatment Research Center, Jilin University, Jilin Changchun (130021)2 Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland, USA (20892)3 University of Maryland School Medicine, Baltimore, Maryland, USA (21201)AbstractObjective
36、: To explore the effect of co-expressed siRNA-survivin and p53 on the proliferation activity of prostate cancer cell PC-3. Methods: To detect the protein levels of mutant p53(mt-p53) and survivinproteins by immunohistochemical staining in normal and malignant prostate tissues. After construction and
37、 identification of a recombinant plasmid with two antitumor factors of siRNA-survivin and p53, thesurvivin and p53 mRNA expressions in samples extracted from transfected cells were performed byRT-PCR. MTT assay was used to detect the inhibition rate of cell proliferation, and cell cycle phase were a
38、lso analyzed by flow cytometry. Results: immunohistochemical results showed that theexpression of mt-p53 and survivin proteins in prostate cancer tissues was higher than that in normal prostate tissues(P0.001), and the expression of survivin was correlated with that of p53 protein (rs0.514，P0.020).
39、The recombinant Psp53 plasmids with siRNA-survivin and p53 was successfullyconstructed, and this was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequence analysis. RT-PCR results showed the decreased survivin mRNA expression and increased wt-p53 mRNA expression in cells transfected with co-exp
40、ressed plasmid (P0.01). MTT assay demonstrated that the Psp53 treatment suppressed PC-3 cell growth significantly. FCM analysis showed that an increase in the percentage of cells in G1 stage of cell cycle and a significant decrease in the percentage of cells in S phase in Psp53 treatment group(P0.01). Conclusions: It was constructed successfully the co-expressed plasmid Psp53 which can express both siRNA-survivin and p53 protein, and it have a synergetic inhibition on the growth of prostate cancer cell in vitro.Keywords: p53; surviving; prostate cancer; RNAi
