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1、精品论文检测 Fascin 与 p-Sp1 共表达预警食管鳞癌患者预后曹卉慧1，郑春鹏2，王少洪3，吴健谊4，许秀娥1，吴智勇2，傅俊惠2，沈金辉3，5李恩民4，许丽艳1（1. 汕头大学医学院肿瘤病理研究室，汕头，515041；2. 汕头市中心医院肿瘤外科，汕头，515041；3. 汕头市中心医院病理科，汕头，515041；4. 汕头大学医学院生化与分子生物学教研室，汕头，515041）10摘要：细胞骨架微丝 F-Actin 捆绑蛋白 Fascin，在食管鳞癌组织细胞中显著高表达，与食管 鳞癌患者的生存期缩短等相关，可作为食管鳞癌患者预后不良的预警分子。有报道发现，Fascin 的高表达主要由
2、活性转录因子 p-Sp1 激活，因此本文采用免疫组化的方法联合检测了Fascin 与 p-Sp1 的表达情况，以及与各临床指标间的相关性，结果显示，在食管鳞癌组织细15胞中，与单独检测 Fascin 表达相比，联合检测 Fascin 与 p-Sp1 共表达，可明显提高准确预 警食管鳞癌患者 5 年生存率的特异性，为预警食管鳞癌患者预后的最佳的独立判定因子。关键词：Fascin；p-Sp1；食管鳞癌；预后不良中图分类号：R446.820Coexpression of Fascin and p-Sp1 promts patients ofEsophageal Squamous Cell Carci
3、noma with poor prognosisCAO Huihui1, ZHENG Chunpeng2, WANG Shaohong3, WU Jianyi4, XU Xiue1, WU Zhiyong2, FU Junhui2, SHEN Jinhui3, LI ENmin4, XU Liyan1(1. Institute of Oncologic Pathology,Medical College of Shantou University,Shantou,515041;252. Departments of Oncology Surgery, Shantou Central Hospi
4、tal, Shantou, 515041;3. Departments of Pathology, Shantou Central Hospital, Shantou, 515041;4. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Shantou University, Shantou, 515041)Abstract: Fascin, actin-binding protein, whose overexpression in Esophageal Squamous Cell30Carcinoma
5、(ESCC) is associated with aggressive clinical phenotypes and poor prognosis. There is a report that the overexpression of Fascin regulated by p-Sp1 as the result of the epidermal growth factor/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway activation. In the present study, Immunohistochemis
6、try applied to tissue microarray technology were performed to examine the coexpression status of Fascin and p-Sp1 and their impacts on the clinical characteristic of patients35with ESCC. Our result suggest that high coexpression of Fascin and p-Sp1 correlates with poor outcome, and can improve Speci
7、ficity.Key words: Fascin；p-Sp1；ESCC；poor prognosis0引言40以往，许多实验室1-9在各自的实验中曾先后研究发现，细胞骨架微丝 F-Actin 捆绑蛋白 Fascin，在食管鳞癌组织细胞中显著高表达，主要参与癌细胞的异常分裂增殖与侵袭移动， 与食管鳞癌患者的生存期缩短等密切相关，可作为食管鳞癌患者预后不良的预警分子。在此基金项目：中国高等教育博士点科研基金项目资助（20094402110005）作者简介：曹卉惠（1986 年-），女，硕士研究生，食管癌分子病理学通信联系人：许丽艳（1964 年-），女，研究员，食管癌分子病理学. E-mail:
8、liyanxu1130- 2 -基础上，Lu XF 等人10进一步研究证明，在食管鳞癌组织细胞中，Fascin 的高表达主要由活性转录因子 p-Sp1 激活。在本文中，我们的实验研究结果表明，联合检测食管鳞癌组织中45Fascin 与 p-Sp1 蛋白的共表达情况，比单独用 Fascin，可以更好地预警食管鳞癌患者的生存 期。现详细报道如下。1材料与方法1.1组织标本来源与组织芯片制作广东省汕头市中心医院，1987 年 11 月至 1998 年 10 月，342 例外科食管鳞癌手术根治50患者，均经临床病理确诊，取癌组织蜡块标本，按标准方法制作组织芯片 67 微阵列，每例 组织标本至少两个芯点
9、，直径 1.8mm。去除实验操作中掉片、叠片，以及癌组织少于 5%的 病例，最终得到 Fascin 与 p-Sp1 共表达的有效病例 217 例，中位年龄 55 岁。临床分期按国 际抗癌联合会 2010 年标准行 TNM 分期，相关临床资料见表 1。1.2免疫组化检测55上述食管鳞癌组织芯片切片后，56过夜烤干。通过免疫组化二步法，检测 Fascin 与p-Sp1 的表达情况。鼠抗人 Fascin 单克隆抗体购自丹麦 DAKO 公司，兔抗人 p-Sp1（phosphoT453）多克隆抗体购自英国 Abcam 公司，免疫组化二抗试剂盒 PV-9000 购自北京 中杉金桥生物技术有限公司。Fasc
10、in 抗体和 p-Sp1 抗体的稀释倍数为 1:100，PV-9000 为即 用型试剂，DAB 染色，苏木素复染。染色步骤按说明书进行，以 PBS 液代替一抗作为阴性60对照。1.3结果判定标准Fascin 以细胞浆出现浅黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞。评分标准：强度评分，0 为不显 色，1 为弱染色，2 为中染色，3 为强染色；阳性细胞比例评分，0 为5%，1 为 5-25%，2 为 26-50%，3 为 51-75%，4 为75%。将两种评分相乘，0-10 分者为低表达组，10 分者65为高表达组。p-Sp1 以细胞核出现浅黄色至棕黄色颗粒为阳性细胞。评分标准：不显色者为 0；散在 肿瘤细胞阳
11、性，或少于 30%的肿瘤细胞弱显色者为 1+；成簇细胞中至强显色，但少于 30% 的肿瘤细胞阳性，或多于 30%的肿瘤细胞弱显色者为 2+；多于 30%的肿瘤细胞中至强显色 者为 3+。0 与 1+、2+合并为低表达组， 3+为高表达组。70Fascin 与 p-Sp1 联合，分 Fascin 与 p-Sp1 共高表达组与其他组。1.4统计方法采用 SPSS13.0 统计分析软件，Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 表达与临床资料的关系采 用 Kendalls tau-b 检验。生存分析 Kaplan-Meier 曲线采用 Log-rank 检验。Cox 回归用于检测 各项
12、指标能否作为独立预后因子。ROC 曲线分析各组蛋白表达对生存期判断的特异性和灵75敏性。P0.05 为差异有统计学意义，P0.01 为差异有显著统计学意义。表 1 食管癌患者临床特征与生存信息Table 1 Survival information of the patient by clinical characteristicsClinical ParametersNo.Five Year Survival Rate (%)P*/*Age (year)5510145.60.8995511640.8- 10 -GenderTumor sizeMale16041.90.629Female574
13、6.53cm5354.80.0333-5cm12543.15cm3926.8Differentiation gradeG14759.60.010G213043.2G34024.1Invasive depthT1+T23444.70.583T3+T418342.8Lymph node metastasisN013755.30.000N18022.4Distant metastasisTNM classificationM020844.90.018M1911.1IA+IB+IIA+IIB13953.70.000IIIA+IIIB+IIIC+IV7824.8Note: Statistical ana
14、lysis: Kaplan-Meier curves (log-rank test)* P Values0.05 were considered significant.* P Values0.01 were considered excellent significant.2结果2.1Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 在食管鳞癌组织中的表达有关 Fascin 在食管鳞癌组织中表达的检测结果见图 1。从图 1 可见，在食管鳞癌组织中，Fascin 的染色主要位于癌细胞的胞浆，呈棕黄色颗粒，同时间质中的细胞，尤其是血管内皮80细胞也有明显染色。在 217 例食管鳞癌组织中，
15、癌细胞浆强染色 74 例（34.1%），弱或中 等强度染色 137 例，仅 6 例未见染色。有关 p-Sp1 在食管鳞癌组织中表达的检测结果见图 2。从图 2 可见，p-Sp1 的染色主要 位于癌细胞的胞核，呈棕黄色颗粒。在 217 例食管鳞癌组织中，129 例呈现多于 30%的阳性 细胞中等或强胞核显色，阳性率 59.4%；65 例呈现弱胞核显色或少于 30%的阳性细胞中等85或强胞核显色，或散在的胞核阳性染色；23 例胞核染色缺失。另外，Fascin 与 p-Sp1 在食管鳞癌组织中共高表达者 49 例，其他 168 例，共高表达阳 性率 22.6%。图 1 Fascin 在食管癌组织中的
16、表达。a，癌细胞浆无染色，间质细胞染色（0 分）；b，癌细胞浆弱染色（490分）；c，癌细胞浆中等染色（8 分）；d，癌细胞浆强染色（12 分）。标尺：50mFig.1 Expression of Fascin in ESCC. a, Score of 0; b, Scores of 4; c, Scores of 8; d, Scores of 12. Bar: 50m图 2 p-Sp1 在食管癌中的表达。a, 癌细胞核中无染色（0）; b, 癌细胞核弱染色（1+）; c, 癌细胞核中等染95色（2+）; d, 癌细胞核强染色（3+）。标尺：50mFig.2 Expression of p-
17、Sp1 in ESCC. a, 0; b, 1+; c,2+; d, 3+. Bar: 50m1002.2Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 的表达与食管鳞癌临床病理特征的关系Kaplan-Meier 生存分析结果显示，食管癌患者的 5 年生存率与肿瘤大小、组织的分化程 度、淋巴结转移、远处转移和 pTNM 分期相关，详见表 1。Kendalls tall-b 相关性分析结果表明，Fascin、p-Sp1 以及 Fascin/p-Sp1 的表达与各临床 病理特征之间均未见显著性相关，详见表 2。表 2 Fascin 与 p-Sp1 表达特征与临床病理的相关性Table 2A
18、ssociation between protein expression and clinical pathological parameters in ESCCstatusClinical Parametersp-Sp1FascinLowHighLowHigh+Age (year)5538630.48867341.00079220.871Gender55Male506866920.3507610540551.0008912527350.713Female203738194314Tumor size3cm16370.20736170.70938150.1003-5cm566982439629
19、5cm16232514345DifferentiationG118290.38431160.31136110.593G2597181499931G31129319337Invasive depthT1+T216180.44921130.6942770.828T3+T4721111226114142Lymph Node metastasisN062750.08590471.000109280.400N1265453275921Distant metastasisM0871210.087137711.000162460.688M1186363TNM classificationIA+IB+IIA+
20、IIB61780.19791480.882110290.499IIIA+IIIB+IIIC+IV275152265820P*p-Sp1/FascinP*P*Note: Statistical analysis: the Kendalls tall-b testp-Sp1, Low expression (score of 0-2), High expression (score of 3); Fascin , Low expression (score of 0-10); High expression (score of 12); p-Sp1/Fascin, +, High expressi
21、on of both p-Sp1 and Fascin; , Others, * P Values0.05 wereconsidered significant.1051101152.3Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 的表达与食管鳞癌患者生存期的关系Kaplan-Meier 生存分析结果显示，1）食管鳞癌患者的 5 年生存率，Fascin 低表达者为46.1%，中位生存时间 41.0 个月，Fascin 高表达者为 37.2%，中位生存时间 35.0 个月，P=0.048， 说明 Fascin 表达与食管鳞癌患者生存期的长短相关，Fascin 高表达的食管鳞癌患者的生存
22、期 短，详见图 3；2）食管鳞癌患者的 5 年生存率，p-Sp1 低表达者为 54.9%，中位生存时间 63.0 个月，p-Sp1 高表达者为 33.9%，中位生存时间 37.5 个月，P=0.013，说明 p-Sp1 表达与食管鳞癌患者生存期的长短相关，p-Sp1 高表达的食管鳞癌患者的生存期短，详见图 4；3） Fascin/p-Sp1 共高表达组食管鳞癌患者的 5 年生存率更低，为 27.9%，中位生存时间 21.5 个 月，而其他组食管鳞癌患者的 5 年生存率为 47.4%，中位生存时间 41.0 个月，P=0.004，详 见图 5。图 3 Fascin 表达状态与食管癌患者生存期的关
23、系Fig.3 Overall survivals of 217 patients with ESCC according to Fascin expression120125130图 4 p-Sp1 表达状态与食管癌患者生存期的关系Fig. 4 Overall survivals of 217 patients with ESCC according to p-Sp1 expression图 5 p-Sp1/Fascin 共表达状态与食管癌患者生存期的关系Fig. 5 Overall survivals of 217 patients with ESCC according to Fascin
24、 and p-Sp1 status2.4Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 的多因素 Cox 回归分析多因素 Cox 回归分析结果见表 3。从表 3 可见，虽然 Fascin 和 p-Sp1 均可作为独立因子 单独预警食管鳞癌患者的预后不良，风险度分别为 1.540 和 1.505，但依然低于局部淋巴结 转移预警的风险度；而 Fascin/p-Sp1 联合在一起，即二者共高表达预警食管鳞癌患者预后不 良的风险度更高，达 2.129，超过了局部淋巴结转移这一危险因素，为预警食管鳞癌患者预后不良的最佳的独立判定因子。表 3 预测总生存期的 Cox 多因素分析Table 3 Co
25、x multivariate regression analysis for predicting overall survivalRisk ratio95% CI of RRP*/*Tumor size(3cm vs 3-5cm)0.5340.681(0.293-0.974)0.041Tumor size(3cm vs 5cm)0.6150.504(0.383-0.987)0.044p-Sp1 (low vs high)1.5051.257(1.002-2.259)0.049Regional lymph nodes (N0 vs N1)2.0461.658(1.379-3.037)0.000
26、Fascin (low vs high)1.5401.216(1.047-2.263)0.028Regional lymph nodes (N0 vs N1)2.3381.810(1.602-3.412)0.000Tumor size(3cm vs 3-5cm)0.4420.580(0.238-0.818)0.009Differentiation(G1 vs G2)0.4690.677(0.240-0.917)0.027Tumor size(3cm vs 5cm)0.5840.581(0.362-0.943)0.028Regional lymph nodes (N0 vs N1)1.7621.
27、526(1.157-2.683)0.008Fascin / p-Sp1(coexpression vs others)2.1291.927(1.373-3.300)0.001* P Values0.05 were considered significant.* P Values0.01 were considered excellent significant.1352.5Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 的特异性与灵敏性的综合评价采用 ROC 曲线分析方法，对通过检测 Fascin、p-Sp1 及 Fascin/p-Sp1 表达预警食管鳞癌 患者 5 年生存率的特异性
28、与灵敏性进行综合评价，相关结果见图 6。从图 6 可见，Fascin 和 p-Sp1 的特异性与灵敏性，前者分别为 71%与 39.3%，后者分别为 48.2%与 67.3%；而将 Fascin/p-Sp1 联合在一起，即二者共高表达，其预警食管鳞癌患者 5 年生存率的特异性明显升高，达到 83.7%，但灵敏性有所降低，为 29.0%，这符合串联联合的统计分析规律。140145150图 6 p-Sp1, Fascin 及二者联合的特异性与敏感性Fig.6 ROC curve of p-Sp1, Fascin, or both, for all patients with ESCC3讨论作为细胞
29、骨架微丝 F-Actin 的捆绑蛋白，Fascin 蛋白的主要功能是捆绑 Actin 成束，在 以 Actin 为基础的细胞突出的形成中发挥功能，与细胞的移行、运动、粘附以及相互作用等 生物学行为密切相关。Fascin 蛋白编码基因位于染色体 7p22，基因全长 13852bp，5 个外显子，成熟转录本长 度 2812bp，5UTR 的长度 132bp，3UTR 的长度 1182bp。有关 Fascin 基因的转录调控机制 研究，Hou J 等人11的实验结果提示，尽管 Fascin 基因的启动子与第一外显子区存在着 CpG 岛，但是，在食管癌组织细胞中，Fascin 基因的转录并不受甲基化修
30、饰调控。近年来有人12-14 先后研究报道，在食管癌组织细胞中，Fascin 基因存在着转录后水平的 miRNA 的调控， miR-143、miR-145、miR-133a 和 miR-133b 可能靶向调控 Fascin 基因。而 Lu XF 等人10研 究证明，在食管癌组织细胞中，Fascin 基因的转录表达主要由 EGFRMEKERK 信号通155160165170175180185190195200路介导，最终由活性转录因子 p-Sp1 激活，Fascin 基因的启动子区存在着 p-Sp1 的结合位点。由此可见，Sp1 的活化与 Fascin 基因的转录激活隶属于同一信号通路控制之下，
31、Sp1 与 Fascin二者之间是一种紧密的上下游关系。以往，包括我们在内，国内外曾有多家实验室1-9先后研究发现，Fascin 基因在食管鳞 癌组织细胞中显著高表达，Fascin 蛋白主要参与癌细胞的异常分裂增殖与侵袭移动，与食管 鳞癌患者的生存期缩短等密切相关，可作为食管鳞癌患者预后不良的预警分子。基于上述情况，我们设想，如果把检测 Fascin 与 p-Sp1 联合在一起，因为二者具有紧密 的上下游关系，也许会明显提高预警食管鳞癌患者预后不良的特异性等。本文的实验结果表 明，单独检测 Fascin 高表达预警食管鳞癌患者生存期缩短的特异性是 71%，而如果把 Fascin/p-Sp1 联
32、合在一起，即检测二者共高表达，其预警食管癌患者生存期缩短的特异性明 显升高，达到 83.7%。而多因素 Cox 回归分析结果表明，如果将 Fascin/p-Sp1 联合在一起， 即二者共高表达预警食管癌患者预后不良的风险度，达 2.129，不但明显优于单独的 Fascin 或 p-Sp1 的任何一种情况，甚至超过了局部淋巴结转移这一传统危险因素，成为预警食管癌 患者预后不良的最佳的独立判定因子。因此，将 Fascin/p-Sp1 联合在一起，检测二者共高表 达，对预警食管癌患者预后不良的确有其内在的优越性。4结论本文研究表明，联合检测 Fascin 与 p-Sp1 共表达，可明显提高准确预警食
33、管鳞癌患者 5年生存率的特异性，为预警食管鳞癌患者预后的最佳的独立判定因子。参考文献 (References)1 Rong J, Xu LY, Cai WJ, Xiong XD, Li JT, Fang WK, Shen ZY, Li EM. Expression of fascin 1 gene in the process of the immortalized esophageal carcinoma carcinogenesisJ. Ai Zheng. 2004,23(3):243-248.2 Xie JJ, Xu LY, Zhang HH, Cai WJ, Mai RQ, Xie Y
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