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1、精品论文拟南芥新内源自噬检测株系的建立闫思源，苏晶，熊杰，龚清秋（南开大学生命科学学院，天津 300071）5摘要：自噬是一条广泛存在于真核生物细胞中的高通量蛋白降解途径。在酵母与动物细胞中， 对自 噬体的观 察主要通 过观测荧 光蛋白标 记 的 ATG8 蛋 白 进行。 植物中虽 然已 有35S:GFP-ATG8 自噬指示载体的报道，但由于过表达 ATG8 会改变植物的发育进程，因此我 们重新构建 ATG8 自身启动子驱动 GFP-ATG8 表达的自噬指示载体，获得转基因拟南芥， 并对其进行植物发育进程分析。最终获得了一个对发育影响较小且能正确指示自噬的株系。10关键词：植物学；自噬；ATG
2、8中图分类号：Q291Construction of an optimized autophagy marker line inArabidopsis15YAN Siyuan, SU Jing, XIONG Jie, GONG Qingqiu(College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071)Abstract: Autophagy is a high-throughput protein degradation pathway. Essential to this process is the formation of au
3、tophagosomes. In yeast and animal cells, the observation of autophagosomes is achieved mainly through the observation of fluorescent protein labeled ATG8 (LC3 in animals).20There have been reports on the application of 35S:GFP-ATG8 in plants. Nevertheless, theover-expression of ATG8 has been shown t
4、o have an impact on plant development. We consider it necessary to reconstruct the vector. In this study, pATG8a:GFP-ATG8a was constructed and introduced to Arabidopsis, and stable transgenic lines were evaluated. One line was found to have little phenotypic differences from the wild-type, and is su
5、itable for monitoring autophagy.25Keywords: Plant biology; autophagy; ATG80引言自噬是真核生物细胞内一条重要的高通量蛋白降解途径 1，通过前自噬体结构逐步形 成自噬体后被吞入液泡而进行。在分子水平上，在营养缺乏条件下，ATG1 和 ATG13 去磷30酸化，形成 ATG1ATG13 激酶复合体而活化，在 VPS15、VPS34、ATG2、ATG9 和 ATG4等蛋白因子的参与下促进前自噬体结构 PAS 的形成2。由 PAS 形成自噬体的过程是通过两 个类泛素共轭系统 ATG8-PE 和 ATG12-ATG5 来实现的。A
6、TG8 在蛋白酶 ATG4 的作用下切 去 C 末端的氨基酸而成熟，和 ATG12 一样，在 ATP 参与下被泛素活化酶 ATG7 活化，然 后分别在泛素交联酶 ATG3 和 ATG10 作用下与 PE 和 ATG5 形成 ATG8-PE 和 ATG12-ATG535复合物2。这个共轭复合体促进自噬泡的形成和封闭，以及到液泡的投递2。 植物细胞中蛋白质的更新包括短寿命蛋白的降解、错误蛋白的清除、碳氮营养元素的回收等。已知短寿命蛋白一般通过泛素-26S 蛋白酶体途径降解，而长寿命蛋白和细胞器蛋白 则主要通过自噬途径来降解3。在植物中也发现了编码自噬相关蛋白 ATG 的同源基因，如 ATG2 ，A
7、TG3 ，ATG5 ，ATG8 ，ATG10 ，ATG12 等，且类泛素共轭系统 ATG8-PE 和40ATG12-ATG5 对于植物自噬也是必需的4。有趣的是，拟南芥中很多 ATG 蛋白并非单基因 产物，比如 ATG8 有 9 个编码基因（AtATG8a-i）。基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金（20090031120027）；天津市应用基础及 前沿技术研究计划（11JCZDJC16400）；国家自然科学基金国家基础科学人才培养基金（J1103503） 作者简介：闫思源，（1990-），男，学士，细胞自噬。通信联系人：龚清秋，（1980-），女，副教授，植物胞内运输与信
8、号转导。E-mail: gongq- 5 -为了直观地观察自噬，在酵母和动物中选用融合蛋白 GFP-ATG8/LC3 标记自噬小体 5。 在植物中也有将 GFP-ATG8a 和 GFP-ATG8e 等作为标记的报道6-7。之所以选择 ATG8a 和 ATG8e，是因为它们在植物的各个组织和器官中表达量相对较高4且响应低氮胁迫等自噬启45动条件6。对植物自噬流的观察还需要使用伴刀球霉素 A（concanamycin A）来抑制液泡质 子泵的活性 6。到目前为止，在植物中使用的融合蛋白 GFP-ATG8 都是由来自烟草花叶病毒的 35S 启动子驱动表达的。他人和我们的前期研究表明，过表达 ATG8
9、 会显著改变植物的发育进程和 抗性，比如早花与抗盐性的减弱8-9。50为建立更好的植物自噬检测株系，我们克隆了 AtATG8a 启动子与编码序列，构建了 pATG8a:GFP-ATG8a。稳定转化拟南芥获得了多个转基因株系。选择两个 T3 纯合株系进行 发育表型分析，发现其中一个与野生型发育状态接近，且 GFP-ATG8 蛋白积累显著响应氮 胁迫。此株系将被应用于植物自噬检测。1实验材料与方法551.1实验材料与试剂拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Columbia-0）；大肠杆菌(E coli.) DH5 菌株； 双元载体 pCAMBIA1302。Ex Taq 酶,
10、Taq 酶, Pyrobest 等 DNA 聚合酶及各自相应的 10缓冲液； EcoR I, Nco I,Pst I, Hind III, BstE II 等限制性内切酶及各自相应的 10缓冲液，碱性磷酸酶 CIAP；卡那霉60素（Kanamycin）；潮霉素（Hygromycin）；水饱和酚，氯仿, 无水乙醇，异丙醇，溴化乙 锭（EB），Tris，EDTA，氢氧化钾，氯化钠，去离子水，液氮，甘油，蒸馏水，dNTP，10上样缓冲液，Trans2K plus Marker；质粒小提试剂盒， 琼脂糖凝胶回收试剂盒， CloneEZ重组克隆试剂盒； LB 培养基, 1/2MS 培养基。伴刀球霉素 A
11、（CA），二甲基亚砜（DMSO），-巯基乙醇，无水乙醇，蛋白酶抑制65剂（cocktail），甲醇，正丁醇，变色硅胶，甘氨酸，Tris，Tricine，SDS，溴酚蓝，过硫酰 胺（AP），丙烯酰胺，TEMED，NaCl，KCl，Tween-20，奶粉，甘油，KOH，HCl，尿素， 蛋白定量用考马斯亮蓝染液，牛血清蛋白（BSA），蛋白 PageRuler Marker ，Millipore ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substate，盐酸胍；anti-GFP 抗体（Invitrogen， Sigma，Roche）；anti-Mouse 抗体（
12、LK2003）（三箭）；anti-Rabbit 抗体（Abmart）。701.2实验方法1.2.1自噬载体的构建图 1 载体构建流程75引物设计、PCR、PCR 产物纯化、载体线性化与重组、转化、转化子筛选鉴定等按分子克隆常规方法进行。载体构建流程如图 1 所示。实验中用到的引物如下。 启动子扩增：pATG8a:GFP F CCTCTAGAGTCGACCCCGACACAAGGTTAAGGGGCTCG80pATG8a:GFP R CTAGTCAGATCTACCATCGATCGTCTGCTAGATCGGGGGA构建：GFP-ATG8a FCACCACCACCACGTGATGATCTTTGCTTGC
13、TTGAAATTCGGFP-ATG8a RGGGGAAATTCGAGCTTTATTCAAGCAACGGTAAGAGATCC验证：851302GFP-NCACCTTCACCCTCTCCACTGACAG1302GFP-CGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAG W1FTGTATACGTGGTTCGTAAAA1.2.2转基因拟南芥的获得与培养 将构建好的质粒利用农杆菌介导的花苞浸泡法进行拟南芥转化，通过抗性筛选及 PCR90鉴定最终获得转基因株系。植物生长基本条件：培养基质为泥炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1；温度 221；16 小时光照/8 小时黑暗。1.2.3免疫印迹实验 按常规方法进行
14、。952实验结果与讨论2.1载体的构建载体 pATG8a:GFP-ATG8a 的构建，如图 2 所示。MCS Lac Z alpha fragmentCAM V 35SHygpAT G8aGFPT-DNA LBHin dIII (2 41 2 )AT G8aKanapATG8a:GFP-ATG8a1194 1 bpHin dIII (26 81 )NO S 3UT R T-DNA RB100pBR322 origin pBR322 bom sitpVS1 origin图 2 重组质粒 pATG8a:GFP-ATG8apVS1 Sta105ATG8a 启动子 pATG8a 的 PCR 产物和载体
15、 pCAMBIA1302 的线性化回收使用的引物为 pATG8a:GFP F 和 pATG8a:GFP R，DNA 聚合酶为 Ex Taq 酶，退火温度57，循环数 32，延伸时间 90 s，模板为 WT 基因组 DNA，产物大小为 1266 bp。载体 pCAMBIA1302 的线性化使用的限制性内切酶为 Pst I 和 Nco I。本实验琼脂糖凝胶电泳使用 的 Marker 均为 Trans2K plus Marker，其条带由小到大依次为 100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 kb，2 kb，3 kb，5 kb。其中 750 bp 的条带浓度为 20 ng/l, 其
16、余为 10 ng/（l见图 3）。pATG8a的 PCR 结果如图 3 所示，载体 pCAMBIA1302 的线性化回收结果如图 4 所示。110115图 3 pATG8a 的 PCR 结果 图 4 载体 pCAMBIA1302 线性化回收结果菌落 PCR 检测菌落 PCR 使用的引物也是 pATG8a-GFP F 和 pATG8a-GFP R，DNA 聚合酶为 Taq 酶， 退火温度为 57 ，循环数为 30，延伸时间为 90 s。一共挑取了 8 个单菌落来检测，依次编 号为 pATG8a:GFP 1，2，3，8 号菌。正对照模板为 1 l WT 基因组 DNA。如图 5 所示，1，2，5，
17、6，7，8 为阳性结果。图 5 pATG8a:GFP 菌落 PCR 检测结果- 8 -120125130135140酶切检测挑取 pATG8a:GFP 的 1，2 号菌振荡培养后进行酶切检测，使用的酶是 EcoR I，其中一 个位点在 pATG8a 序列内，酶切产物小片段长度为 980 bp。酶切结果如图 6 所示。图 6 pATG8a:GFP 1，2 号菌酶切结果将 pATG8a:GFP 1 号菌测序后，与原序列比对无误。 载体 pATG8a:GFP-ATG8a 的构建ATG8a 基因序列的 PCR 产物和载体 pATG8a:GFP 的线性化回收结果使用的引物为 GFP-ATG8a F 和
18、GFP-ATG8a R（引物序列见附录），DNA 聚合酶为 Ex Taq 酶及 Pyrobest DNA 聚合酶，退火温度为 51，循环数为 32，延伸时间为 1 min，模板 为 WT 基因组 DNA，产物大小为 976 bp。载体 pATG8a：GFP 的线性化使用的限制性内切 酶为 BstE II，并经 CIAP 处理。PCR 产物与 pATG8a:GFP 酶切回收结果如图 7 所示。图7 ATG8a PCR 产物和 pATG8a:GFP 酶切回收结果菌落 PCR 检测菌落 PCR 使用的引物是 GFP-ATG8a F 和 GFP-ATG8a R，DNA 聚合酶为 Taq 酶，退火 温度
19、为 56，循环数为 30，延伸时间为 1 min。共挑取 8 个单菌落检测，依次编号为 GFP-ATG8a 1，2，3，,8 号菌。正对照模板为质粒。如图 8 所示， 1，4，7 为阳性结果。图8 pATG8a:GFP-ATG8a 菌落 PCR 检测结果酶切检测挑取 pATG8a:GFP-ATG8a 1 号和 7 号菌振荡培养后进行酶切检测，使用的酶是 Hind III， 它的两个酶切位点都在 ATG8a 序列内，酶切产物小片段长度 270 bp。酶切结果如图 9 所示。145图 9 pATG8a:GFP-ATG8a 1 号和 7 号菌质粒酶切结果150155160将 pATG8a:GFP-A
20、TG8a 1 号菌质粒测序后，和原序列比对无误。2.2转基因植物的自噬水平评价与表型观察通过花苞浸泡法获得 pATG8a:GFP-ATG8a 转基因株系，经抗性筛选、PCR 鉴定等获得 T1 代转化子，经抗性筛选获得 T2 代与 T3 代转基因纯合株系。从中选择两个株系 L5-1 与 L12-4，以 GFP 抗体检测 GFP-ATG8a 的积累。如图 10 所示，在缺氮（引发自噬的标准条件 之一）处理后，L5-1 中 GFP-ATG8a 水平显著上升，表明其能够正确响应缺氮。图 10 GFP-ATG8a 在足氮与缺氮条件下在两个转基因株系中的表达。在正常生长的条件下培养 WT 与 pATG8a
21、:GFP-ATG8aT3 代转基因株系 L5-1 与 L12-4， 在培养基上培养 10 天后，选取已经长出真叶、大小相近的植株，移苗至土壤中继续培养直 至植物完成整个生长周期，收获成熟的种子。移苗后，每 7 天对所有植物进行图像采集，图10 为移苗后第 0 天，14 天，21 天及 28 天的代表性植物照片。如图 11 所示，L5-1 和 L12-4 株系的生长状态略优于 WT，表现在莲座叶大小和株高等 方面。两个株系均无异常表型。与 L12-4 相比，L5-1 更接近野生型。图 11 两个 T3 纯合株系正常培养条件下的表型。上三行图中标尺=1 cm，第四行图中标尺=10 cm。16517
22、01753结论本文针对目前常用植物自噬检测转基因株系具有发育表型这一问题，构建了由内源启动 子驱动 GFP-ATG8 表达的新检测载体，并获得了转基因拟南芥株系。其中一个 T3 代纯合株 系 L5-1 经免疫印迹检测，GFP-ATG8 蛋白水平受到缺氮诱导，且该株系在正常生长条件下 表型与野生型差异较小，可作为更好的自噬检测株系应用。致谢我们感谢实验室成员参与讨论。 闫思源受到国家自然科学基金国家基础科学人才培养 基金的资助（J1103503），龚清秋受到教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金（20090031120027）与天津市应用基础及前沿技术研究计划（11JCZDJC16400
23、）资助，特此致谢。参考文献 (References)1801851901 Yang Z, Klionsky DJ. Eaten alive: a history of macroautophagy.Nat Cell Biol. 2010 Sep;12(9):814-22.2 Xie Z, Klionsky DJ. Autophagosome formation: core machinery and adaptations. Nat Cell Biol. 2007Oct;9(10):1102-9.3 Bassham DC. Plant autophagy-more than a starvat
24、ion response. Curr Opin Plant Biol. 2007 Dec;10(6):587-93. 4 Thompson AR, Doelling JH, Suttangkakul A, Vierstra RD. Autophagic nutrient recycling in Arabidopsis directed by the ATG8 and ATG12 conjugation pathways. Plant Physiol. 2005 Aug;138(4):2097-110.5 Klionsky DJ, Cuervo AM, Seglen PO.Methods fo
25、r monitoring autophagy from yeast to human.Autophagy.2007 May-Jun;3(3):181-206.6 Yoshimoto K, Hanaoka H, Sato S, Kato T, Tabata S, Noda T, Ohsumi Y. Processing of ATG8s, ubiquitin-like proteins, and their deconjugation by ATG4s are essential for plant autophagy. Plant Cell. 2004Nov;16(11):2967-83.7
26、Contento AL, Xiong Y, Bassham DC. Visualization of autophagy in Arabidopsis using the fluorescent dye monodansylcadaverine and a GFP-AtATG8e fusion protein. Plant J. 2005 May;42(4):598-608.8 Slvikov S, Shy G, Yao Y, Glozman R, Levanony H, Pietrokovski S, Elazar Z, Galili G. The autophagy-associated
27、Atg8 gene family operates both under favourable growth conditions and under starvation195stresses in Arabidopsis plants. J Exp Bot. 2005 Nov;56(421):2839-49.9 Xia T, Xiao D, Liu D, Chai W, Gong Q, Wang NN. Heterologous expression of ATG8c from soybean confers tolerance to nitrogen deficiency and increases yield in Arabidopsis. PLoS One. 2012;7(5):e37217. doi:10.1371/journal.pone.0037217.
