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1、精品论文多壁碳纳米管对斑马鱼体内组织酶活性的影响刘信勇，朱琳 南开大学环境科学与工程学院，天津（300071） E-mail：langzijian007摘要：在实验条件下,采用毒性实验方法研究三个不同浓度多壁碳纳米管（MWCNTs）长时间暴露对斑马鱼乙酰胆碱酯酶 TchE、谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-PX 和 Na+,K+-ATPase 酶 活性的影响。研究结果表明，随着人工纳米材料浓度的增高乙酰胆碱酯酶 TchE 和谷胱甘肽 过氧化物酶 GSH-PX 的活性降低，Na+,K+-ATPase 酶活性呈先升高后降低的趋势。不同光照 条件下的酶活性略有不同，但其大体趋势基本一致。对人工碳纳米材料与
2、酶活性的定性和定 量分析为有效监控水生生态环境提供了有价值的参考资料。 关键词：斑马鱼，乙酰胆碱酯酶，谷胱甘肽过氧化物酶，Na+，K+-ATPase 酶，多壁碳纳米 管1引言人工纳米材料是指至少在一个几何面上的关键尺寸低于 100nm，并具有高度均匀性的材 料,特别是指以应用为目的被人工制造出来的产品,包括纳米颗粒、纳米管、纳米线和富勒烯 及其衍生物等纳米尺度材料1-2。其中碳纳米管根据其结构不同分为：多壁碳管 (multi2wallcarbonnanotubes,MWCNTs)和单壁碳管(single2wallcarbonnanotubes,SWCNTs)，前 者是由多层石墨片卷积而成的,后
3、者是由单层石墨片卷积而成的。由于尺寸很小,结构特殊, 因此具有许多优良且奇异的物理化学特性，如小尺寸效应、巨大的表面效应、界面效应、极 高的反应活性、量子效应等3，这些特性使其在医药、工业、建筑、化妆品和环保等产业中 具有诱人的前景，也正是因为如此人工碳纳米管对环境以及人体健康的潜在影响和风险也开 始引起各界的广泛关注4-6,相关的毒理学研究具有重要意义。水环境可能受来自产品生产、运输、消费和处置过程中溢出的污染,废弃的或污染事故 也可能导致泄漏进入水环境中7-8。Obrdrster 报道了 0.5mg/L 的富勒烯水溶液(nC60/THF，采用 THF 为助溶剂)暴露 48 后能使大嘴黑鲈(
4、Micropterussalmoides)幼鱼脑组织产生严重的脂质过氧化8，这是有关水生生态毒性的首次报道。Hyung 等9和 Roberts 等10的研究表明, 碳纳米管进入水环境后,在水体有机质的作用下具有较好的分散性和稳定性,极有可能对水生 生物造成潜在危害.尽管如此，仍然缺乏有关的暴露和剂量-效应的毒理学数据,而且还不能确 定纳米材料泄漏到环境中后将处于什么样的数量级别，因而目前尚难以开展对纳米材料的危 害鉴定和风险评价。因此,本文选取了三种酶酶为对象，以斑马鱼为受试生物,研究碳纳米管 进入水环境后的生态毒性效应。主要的目的在于：(1)考察典型的碳纳米材料泄漏进入水环 境后，表现出怎样
5、的水生生态效应；(2)比较不同光暗环境下碳纳米材料生态效应的大小差 异；(3)初步探讨现有的生态毒性测试方法，是否能应用于具有独特理化性质的纳米材料的 生态毒性测定。研究结果将有助于人工纳米材料的生态风险评价，弥补目前在人工纳米材料 生态毒性研究上的空白，也可为有关的法规或标准的制定提供基础。2材料与方法2.1 仪器与材料仪器：紫外-可见光分光光度计，水浴箱，微量移液器，玻璃匀浆器，台式离心机。- 6 -MWCNTs 购自深圳纳米港有限公司，粒径 10-20nm，长度 1-2um，纯度95%，含碳量小于 3%，表面积 40-300m3/g。十二烷基硫酸钠 C12H25O4Sna（简称 SOD）
6、购自北京鼎国 生物技术有限公司。所有玻璃仪器在使用前均用 10%浓硝酸浸泡 48h，并用去离子水冲洗干净，然后经高温 高压(120,15min)灭菌后待用。试验生物为当年生斑马鱼(Brachydaniorerio)，试验前在实验室 23条件下驯养 2 周以上，自然死亡率0.05），A 表示有空白组比较有显著性差异(P0.05），B 表示同浓度不同环境间比较有显著性差异(P0.05）；在暗环境下 MWCNTs 悬浊液中斑马鱼脑组织乙酰胆碱酯酶活性比正常光照条件 下要低，对照组和最大浓度组与正常光照组比较并无显著性差异（P0.05），而在 5mg/L 和2.5mg/L 浓度下，暗环境下的斑马鱼脑内
7、乙酰胆碱酯酶活性与正常光照组差异著性(P0.05）；在暗环境下 MWCNTs 悬浊液中斑马鱼脑组织乙酰胆碱酯酶活性比正常光照条件 下要低，除最大浓度组与正常光照组比较无显著性差异外（P0.05），对照组和其他浓度下， 暗环境下的斑马鱼脑内乙酰胆碱酯酶活性与正常光照组差异著性(P0.05)。这说明了 MWCNTs 进入斑马鱼体内以后，会对斑马鱼肝组织活动产生一定程度的影响，导致谷胱甘 肽过氧化物酶活性降低，不同的光照条件对斑马鱼的生理活动也有一定影响，但在偏低 MWCNTs 浓度下的影响显著，而在高 MWCNTs 浓度下影响不显著，这证明光照条件能够改 变外界物质对斑马鱼肝脏组织的影响。3.3
8、MWCNTs 对斑马鱼脑组织内 Na+,K+-ATPase 酶活性的影响MWCNTs 悬浊液长期暴露对斑马鱼脑组织 Na,K-ATPase 酶活性的影响见表 3：02.551011.290.95b19.090.47Ab15.560.51Ab14.000.55Ab悬浊液浓度 正常光照下表 3 在 MWCNTs 悬浊液长期暴露条件下斑马鱼脑组织内 Na,K-ATPase 酶活性Na+,K+-ATPase 活性 黑暗条件下Na+,K+-ATPase 活性7.670.67b12.030.62ab10.360.72ab9.640.34ab由表 3 可见，在 MWCNTs 悬浊液中长期暴露条件下，不论有无
9、光照，斑马鱼体内组织的 Na+,K+-ATPase 酶活性呈现趋势大致相同，呈现先上升后下降的趋势，单实验组酶活性 均大于对照组；在暗环境下 MWCNTs 悬浊液中斑马鱼体内组织 Na+,K+-ATPase 酶的活性比 正常光照条件下要低；在正常光照条件下，脑组织的 Na+,K+-ATPase 酶活性与对照组相比 有显著性差异，而黑暗环境下则无显著性差异；两种光照条件相比较，不同浓度组的 Na+,K+-ATPase 酶活性变化差异均不显著。这说明了 MWCNTs 进入斑马鱼体内以后，会对 斑马鱼脑组织活动产生一定程度的影响，导致 Na+,K+-ATPase 酶活性变化，不同的光照条 件对斑马鱼
10、的生理活动也有一定影响，但影响不显著。4讨论（1）乙酰胆碱酯酶是一组特异性较强水解酶，存在于中枢神经系统 （如脑）、运动终 板 （如肌肉）、交感神经、红细胞等处，主要作用于乙酰胆碱（胆碱能神经传递介质），使 之水解成为胆碱和乙酸，从而维持神经冲动的正常进行。如乙酰胆碱酯酶活性降低或失活， 则引起乙酰胆碱酯在中枢胆碱能突触、神经肌肉接头等处的积累，表现出各种病状，如惊厥、 麻痹等。本试验结果表明，随着 MWCNTs 浓度的增加和光暗条件的改变，斑马鱼脑组织的 TchE 酶活性被抑制，这一点与我们在染毒过程中所观察到的鱼的表现行为基本一致。另外， Ch ristensen12研究发现溪鳟鱼在受到环
11、境胁迫时血清胆碱酯酶活性增加，对照本实验结果 分析，这可能是 MWCNTs 引起细胞膜通透性增加，细胞内的 TchE 大量释放出来进入血浆， 从而引起血清中 TchE 活性的增加，而组织内 TchE 活性下降。（2）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶， 起保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害的作用。它的一个重要特征是其活性 可由于污染的胁迫而发生改变。Rodriguez-Ariza12报道，从污染水域捕获的鲻鱼比未受污 染水域的鲻鱼肝脏 SOD、CAT 和 GPx 活性均显著升高。Mather-Mihaich 和 DiGuilio13则发 现
12、鲶暴露于造纸厂废水中 CAT 活性升高，而 SOD 和 GPx 活性未发生显著变化。这些关于 低浓度污染物长期暴露下鱼类抗氧化酶的变化表明，在污染胁迫下，生物体可通过调节抗氧 化酶水平增强其清除活性氧的能力，以减轻污染物的伤害。本试验中斑马鱼肝脏 GSH-Px 活 性随 MWCNTs 悬浊液浓度的升高和光照时间减少而被抑制，表明在 MWCNTs 代谢过程中 机体内活性氧大量产生，并已对机体产生毒性作用，其毒性作用的机理可能与 MWCNTs 粒 径小、表面积巨大，反映活性高等特殊的理化性质有关 ，关于 MWCNTs 暴露对 GSH-Px 活性可能产生的影响及其机理，值得进一步探讨。（3）Na+,
13、K+-ATPase 酶是主动运输所需要的特殊的运载酶，普遍存在于动物细胞膜上,在与外界进行气体和离子交换的器官或组织的细胞膜上更为集中，是离子跨膜运输的一个主 要的调节者，功能是保证组织或器官细胞膜上的离子平衡，而且 Na+,K+-ATPase 酶与膜上 磷脂的不同结合状态，会使膜的流动性发生改变，从而影响膜的其他功能14。生理处于胁 迫条件下时 ATP 库内的 ATP 含量改变，供能活动和离子平衡等遭到破坏，ATP 酶活性会随 之变化。同时，ATP 酶还能反映能量代谢、物质运输以及氧化磷酸化等生化过程的变化，并 能影响膜的结构。结合本实验结果 Na+,K+-ATPase 酶的改变可能是由于
14、MWCNTs 悬浊液进 入斑马鱼体内以后会附着或者穿透细胞膜，导致了细胞膜损伤，物质运输以及氧化磷酸化等 生化过程的变化。随着时代的进步和科技的发展，人工纳米材料尤其是 MWCNTs 越来越广泛的应用于生 产生活的各个方面，但是关于人工纳米材料的毒理学研究还处于刚刚起步的阶段，如何做到 科技与环境协调发展，建立节约型环保社会是历史交给我们的课题，因此人工碳纳米材料对 生物机体可能的影响及其具体机制还有待于更进一步试验研究。参考文献1 U.S. Environmental Protection Agency,National Center for Environmental Research,
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19、ress in the brain of juvenile largrmouth bass Environmental Health Perspectives 2004,112(10):1058-10628 Hyung H, Fortner J D, Hughes J B, et al. Natural organic matter stabilizes carbon nanotubes in the aqueous phase J. Environ. Sci. Technol., 2007,41(1):179-184.9 Roberts A P, Mount A S, Seda B, et
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22、1991, 20:391-397.14卢建民,卢 玲,蔺玉华,等.低 pH 对鲤鱼组织 Na/KATPase 活性的影响J.水生生物学报, 2001, 25(1):102-104Effects of Multi-walled carbon nanotubes on enzyme activity inTissues of zebra fishLIU Xinyong，ZHU LinThe college of Enviromental Science and Engineering of Nankai University, Tianjin (30071)AbstractIn laborator
23、y ,an experiment was carried out to study the effects of a long time exposure toMulti-walled carbon nanotubes(MWCNTs) on TchE、GSH-PX and Na+,K+-ATPase activity at threeconcentration. The results show that the acetylcholinesterase ( TchE) and glutathione peroxidase (GSH-PX ) in the artificial nano-ma
24、terials with the higher concentration is lower, and the Na+,K+-ATPase activity was reduced after the first rise. In different light conditions, the enzyme activity is slightly different, but the general trend of them is basically the same.The quantitative and qualitative analysis provided useful references for an efficient environment control in MWCNTs pollution in aquaculture.Keywords: zebrafish, acetylcholinesterase, glutathione peroxidase, Na+,K+-ATPase , Multi-walled carbon nanotubes
