罗格列酮抑制糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细.doc

《罗格列酮抑制糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《罗格列酮抑制糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细.doc（8页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、罗格列酮抑制糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细胞正常 T 细胞表达分泌的调节活化蛋白表达增加周莉，马丽，孙子林* 东南大学附属中大医院内分泌科，南京（210009） E-mail：manman_zl摘要：目的探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养的人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子正 常 T 细胞表达分泌的调节活化蛋白(RANTES)基因和蛋白表达的影响以及罗格列酮的干预效 应。方法运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）加或不加罗格列酮干预体外培养 的 HRMC，用半定量 RT-PCR 检测细胞中 RANTES mRNA 水平，用 Western blot 和 ELISA 法分别测定细胞裂

2、解物和培养上清中 RANTES 蛋白水平。结果（1）AGE-BSA 呈浓度和 时间依赖性增加人肾系膜细胞 RANTES mRNA 和蛋白表达；（2）罗格列酮呈浓度依赖性降 低 AGE-BSA 刺激的人肾系膜细胞 RANTES mRNA 和蛋白的表达 。结论罗格列酮能抑制 糖基化终产物诱导的人肾系膜细胞 RANTES 的表达和分泌。关键词：糖基化终产物；正常 T 细胞表达分泌的调节活化蛋白；人肾系膜细胞糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）严重的微 血管并发症之一，是导致终末期肾脏疾病最常见的原因1。近来诸多研究表明，

3、DN 肾脏损 害的实质是炎症反应，而趋化因子在此反应过程中扮演着不容忽视的角色2。正常 T 细胞表 达分泌的调节活化蛋白（regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted, RANTES）是趋化因子 CC 亚家族的成员之一，本实验拟用体外制备的 AGEs 作用于人肾系 膜细胞（human renalmesangial cell, HRMC）并用罗格列酮进行干预，观察 AGEs 对 HRMC 的 RANTES 基因和蛋白表达的影响及罗格列酮的干预效应，为阐明 DN 的发病机制及罗格 列酮的临床应用提供新的实验依据。1.

4、材料和方法1.1.材料1.1.1细胞株人肾系膜细胞（HRMC）株，由阮雄中博士（Renal Unit，Royal Free Hospital，LONDON，UK）惠赠。1.1.2试剂牛血清白蛋白(BSA，AMRESCO)，DMEM 培养基（GIBCO，U.S.A. 低糖），新生小牛 血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Hepes(上海丽珠东风生物技术有限公司)， Trizol（Sangon 产品），M-MLV 逆转录酶（Promega 产品），Taq DNA 聚合酶（Promega 产品），dNTPs（Sangon 产品），RNasin（SABC 产品），Oligo（DT）18（Sangon

5、 产品），DNA ladder（华美公司产品），RANTES 及 -actin 引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。人RANTES 96 孔 ELISA 试剂盒（法国 Immunotech 产品）。其他试剂均为国产分析纯。1.1.3仪器和器材CO2 恒温培养箱(NAPCO)，基因扩增仪(BIO-RAD)，SCR-300 电泳仪(上海万达生物工 程公司)，紫外检测仪（天能科技有限公司），洗板机(Model1575，BIO-RAD 产品)，酶标仪- 8 -(Model 550，BIO-RAD 产品)。1.2. 方法1.2.1 AGEs-BSA 的制备在pH 7.4的 PBS溶液里加入牛血清白蛋白

6、（BSA），使浓度为5.0 gL-1，然后加入一定量 葡萄糖使其终浓度分别为0、20、50、80 mmolL-1，过滤 除菌后37无菌孵育。使用前以 pH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，其余条件一致。取不同时期的 AGE-BSA 2.0 ml 于 650-60 型荧光分光光度计上测其荧光值（激发波长390 nm，发射波长 450 nm，峰狭 5 nm），以 2.0 ml BSA 按同样操作作为对照。1.2.2 HRMC 的培养加入 DMEM 培养液（含 10mmolL-1Hepes、0.37%NaHCO3、100UL-1 青霉素、100UL-1 链霉素及

7、10%灭活小牛血清），置于 37、5%CO2 的饱和湿度培养箱中，隔日换液，每三 天 1:2 传代一次。1.2.3 HRMC 的干预当细胞达到一定数量后将处于对数生长期的细胞按 1:3 移入 6 孔板中，待细胞长到次融 合状态（细胞计数约为 2106）后换用无血清 DMED 培养 24 小时，然后分组干预：（1）分 别用浓度为 0、50 、100 、200 、400、800mg L-1 的 AGE-BSA 干预细胞 48 小时，以 DMEM 组（0mg L-1AGE-BSA 组）作为空白对照；（2）选取敏感浓度 400mgL-1 的 BSA 和 AGE-BSA 分别干预细胞 0、6、12、24

8、、48 小时，以同时间 BSA 作为对照；（3）分别用浓度为 0.1、1、10、100molL-1 的罗格列酮与 AGE-BSA（400mgL-1）共同干预细胞 48 小时，以 AGE-BSA组（400mgL-1）作为对照。1.2.4 RT-PCR 检测细胞 RANTES mRNA 的表达采用 Trizol 一步法提取各组细胞的总 RNA，经紫外分光光度计测定 RNA 的 A260nm 与 A280nm 比值在 1.60-1.80 之间，1%的甲醛变性凝胶电泳证实总 RNA 的完整性较好（28s 与 18s 两条电泳带吸光度比值等于 2:1）。取 2ug RNA 为模板进行逆转录合成 cDNA

9、，然后用特异性引物，以 -actin 作为内参， 在 50l 同一体系中进行 RANTES 和 -actin 共同扩增。 -actin 的引物：上游 5-GGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3，下游 5- ATTGCCAATGGTGATGACCTG-3，扩增片段615bp 。 RANTES 的 引物：上 游 5-ATGAAGGTCTCCGCGGCACGCCTC-3 ，下 游 5- CTAGCTCATCTCCAAAGAGTTGAT -3，扩增片段276bp。PCR 反应条件：94预变性 2min， 然 后 94变性 1min，57退火 1 min，72 延伸 2 min ，共 35 个循

10、环，再以 72延伸 8min。 产物于 1.7%琼脂糖凝胶电泳，由 DNA ladder 进行标记，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行 图像分析。1.2.5 细胞蛋白质的提取和 Western 印迹分析取各样本 50ug 蛋白质进行 SDS-PAGE 电泳分离蛋白，电转移法将蛋白转移至 PVDF 膜， 封闭后分别加入一抗孵育；洗膜后加入 HRP 标记的二抗孵育，充分洗涤后加入增强发光剂， 即刻与底片曝光, 洗片后对电泳条带进行扫描并进行光密度分析。1.2.6 ELISA 法检测细胞培养上清 RANTES 水平用 ELISA 法按照试剂盒使用说明进行。1.2.7 数据处理数据以 Mean+SD 表示

11、，所有数据均使用统计软件 Prism 3.0 进行方差分析。2. 结果2.1 AGE-BSA 对 RANTES mRNA 及蛋白水平的影响2.1.1 不同浓度 AGE-BSA 干预 HRMC（48h）对 RANTES 表达的影响基础状态下，HRMC 微量表达 RANTES mRNA ，其与 -actin 的吸光度比值为0.0220.010；50mg L-1AGE-BSA 干预细胞 48h 后 RANTES 与 -actin 的吸光度比值为0.2720.014，与 DMEM 组相比表达增加，两组间有显著差异（P0.05），且随着 AGE-BSA 浓度的增加，RANTES mRNA 表达逐渐增加，

12、各组 RANTES 与 -actin 的吸光度比值依次 为：100mg L-1 组 0.3140.013、200mg L-1 组 0.4160.014、400mg L-1 组 0.4480.027、800mg L-1 组 0.5500.014，与 DMEM 组相比均有显著差异（P0.05）（图 1a）。HRMC 未干预时上清中有少量的 RANTES 蛋白分泌（18.028.01pg ml-1），AGE-BSA干预后 RANTES 蛋白浓度增加，且随着 AGE-BSA 干预浓度的升高（50、100、200、400 及800mg L-1 ）， RANTES 蛋白的浓度也随之升高（依次为 136.8

13、414.40pg ml-1 、171.1711.98pg ml-1、231.5212.07pg ml-1、307.6812.23pg ml-1、136.8414.40pg ml-1、430.2012.30pg ml-1），与 DMEM 组相比均有显著差异（P0.05）（图 1b）。如图 1c 所示，AGE-BSA 在浓度为 50 mg L-1 时细胞 RANTES 蛋白表达即已升高，与 DMEM 组相比有显著差异（P0.05）。并且，随着 AGE-BSA 浓度的升高，RANTES 蛋白的 表达也随之升高，至 400mg L-1 时为最高，各 AGE-BSA 组与 DMEM 组均有显著差异（P0

14、.05）。各组的 RANTES/Erk 蛋白的 OD 比值分别为：DMEM 组 0.11 0.10、50mg L-1组 0.82 0.45、100 mg L-1 组 1.73 0.86、200 mg L-1 组 3.84 1.25、400 mg L-1 组 6.12 1.30、800 mg L-1 组 4.51 2.21。RANmTES/Cyclot philin0.60.4* *io a RA NR0.6* *io 0.4R * *aAN 0.2R05000.6io 0.4aRAN 0.2R0* *0.20500RA(NgTES Cn. (pg.ml-1)400*400) *300.ml *

15、p 200* *1000500*400) *300.ml *p 200* *1000500*400) *300.ml *p 200* *1000*300*200* *1000RANTES-Erk-8RANTES/Erk o eProtein ratio6* *4AGE-BSA Cn. (mg L-1 )8 * *o 6 *ita rn 4i AGE-BSA Cn* . (mg L-1 )tr 2 *P00 50 100 200 400 8008 * *o 6 *ita rn 4i AGE-BSA Cn* . (mg L-1 )tr 2 *P00 50 100 200 400 8008 * *o

16、 6 *ita rn 4i AGE-BSA Cn* . (mg L-1 )tr 2 *P00 50 100 200 400 80086420*2 *00 50 100 200 400 800AGE-BSA Cn. (mg.L-1)图 1 不同浓度的 AGE-BSA 对 HRMC RANTES mRNA 及蛋白水平的影响*P0.05、*P0.01 vs DMEM（0mg L-1AGE-BSA）2.1.2 相同浓度 AGE-BSA(400mgL-1)干预 HRMC 不同时间对 RANTES 表达的影响以 50 mmol/L 葡萄糖修饰的 AGE-BSA（400 mg L-1）对 HRMC 分别干预

17、 0、6、12、24、48 h，发现 6 h 时 RANTES mRNA 表达即已升高，与基础状态及对照组相比均具有统 计学意义（P0.05），且随着干预时间的延长，RANTES mRNA 表达也随之升高，至 48h 仍 维持较高水平未见下降，与对照组相比均有统计学差异（P0.05），且与 对照组相比也无显著差异（P0.05）。至 12h 组 RANTES 蛋白水平开始明显增高，与对照 组相比具有统计学差异（P0.05），此后随干预时间的延长，RANTES 水平逐渐升高，至48h 仍维持较高水平而未见下降，与对照组相比均有统计学差异（P0.05，图 2b）。各组RANTES 蛋白浓度依次为：0

18、h 组 A 为 18.028.09pg ml-1、B 为 15.688.23；6h 组 A 为39.9011.42pg ml-1、B 为 16.939.19pg ml-1；12h 组 A 为 127.7914.74pg ml-1、B 为18.2010.45pg ml-1；24h 组 A 为 218.4120.23pg ml-1、B 为 53.127.89 pg ml-1；48h 组 A为 307.6812.23pg ml-1、B 为 74.2614.30 pg ml-1。AGE-BSA 在干预 6h 时细胞 RANTES 蛋白表达即已升高，与 0h 相比有显著差异（P0.05）。至 24h 组

19、 RANTES 蛋白水平开始明 显增高，与对照组相比有显著差异（P0.05），48h 仍维持较高水平而未见下降，与对照组 相比有统计学差异（P0.05，图 2c）。各组的 RANTES/Erk 蛋白的 OD 比值分别为：0h 组 A 为 0.10 0.90、B 为 0.100.82；6h 组 A 为 1.230.56、B 为 0.850.54；12h 组 A 为 1.820.82、 B 为 0.920.67；24h 组 A 为 2.021.10、B 为 0.800.82；48h 组 A 为 6.121.30、B 为 0.950.67。0.6RANmTESN/C yclophilin mRNA

20、RatioBSA*#AGE-BSA0.4*#0.6BSA*#AGE-BSAo ia 0.4tRA*#*#R 0.2*#0400BSA*#0.6BSA*#AGE-BSAo ia 0.4tRA*#*#R 0.2*#00.6BSAAGE-BSA0.40.20*#0.2*#AGE-BSA300*#200*#1000TES-0BSARANTES C n. (pg.m l-1)400BSA*#400BSA*#AGE-BSA300*#200*#1000AGE-BSA300*#400BSAAGE-BSA3002001000200*#1000RANTES-Erk-8BSA*#8BSA*#AGE-BSArk i

21、6otE aES/ inr4RANT Petr*#o2*0061224488BSA*#AGE-BSArk i 6otE aES/ inr4RANT Petr*#o2*006122448AGE-BSARANTES/ErkProtein ratio64*#2*006122448干预时间（h）图 2 相同浓度 AGE-BSA 干预不同时间对 HRMC RANTES mRNA 及蛋白水平的影响*P0.05 vs AGE-BSA0h、*#P0.05 vs BSA2.2 罗格列酮对 AGE-BSA（400 mg L-1）诱导的 RANTES mRNA 及蛋白水平 的影响如图 3 所示，罗格列酮在浓度为 0

22、.1molL-1 时即可减少 HRMC 中 RANTES mRNA 及 蛋白的表达，且随着罗格列酮浓度的增加，RANTES mRNA 及蛋白表达量也随之降低，各 浓度组与 AGE-BSA（400 mg L-1）组相比均有有显著差异（P0.05）。各组 RANTES 与 -actin 的吸光度比值分别为：AGE-BSA（400 mg L-1）组 0.450.03、0.1molL-1 组 0.220.45、1molL-1 组 0.20.02、10molL-1 组 0.140.01、100molL-1 组0.120.02。各组上清 RANTES 蛋白浓度依次为：AGE-BSA（400 mg L-1）

23、组 307.6812.23 pg ml-1、0.1molL-1 组 174.3512.88 pg ml-1 、1molL-1 组 136.917.65 pg ml-1 、10molL-1 组129.4114.17 pg ml-1、100molL-1 组 81.7513.06pg ml-1。各组的 RANTES/Erk 蛋白的 OD 比值分别为：AGE-BSA（400 mg L-1）组 6.100.70、0.1molL-1 组 5.20 0.80、1molL-1 组 1.90 0.50、10molL-1 组 1.70 0.60、100molL-1 组1.50 0.60。RANTES/Cyclop

24、hilin mRNA Ratio0.60.40.2* * *0400300200RANTES Cn. (pg.ml-1)100* * *0864*RANTES/ErkProtein Ratio2* * *00 0.1 1 10 100AGE-BSA(400mg/l)+罗格列酮molL-1图 3 罗格列酮对 AGE-BSA（400 mg L-1）诱导的 RANTES mRNA 及蛋白水平的影响*P0.05、*P0.01 vs AGE-BSA3. 讨论DN 的发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明。目前研究已证实，单核/巨噬细胞、T 淋 巴细胞等炎症细胞对肾小球的浸润及间质纤维化是 DN 发生发展中的

25、重要环节。RANTES 作为趋化因子家族中的一员，具有较强的趋化单核细胞、嗜酸性粒细胞和 T 淋巴细胞的作 用。Wang 等3研究发现 RANTES 可能通过趋化巨噬细胞来刺激间质的肌成纤维细胞，从而 导致细胞外基质蛋白的沉积及间质的纤维化。Vielhauer 等4研究显示，通过阻断 RANTES 受体 CCR1，可以减少大鼠梗阻性肾病时间质炎症及纤维化的发生。近来研究还发现， RANTES 及其受体基因的多态性可能与 DN 密切相关5, 6。AGEs 在 DN 发生发展中的作用已经被大量实验所证实，但具体机制还不完全清楚。本 实验室既往的实验已初步观察到 AGEs 对 HRMC RANTES

26、 的分泌有影响7，本实验就这一 问题进行了进一步的研究。实验结果显示，随着 AGE-BSA 干预（48h）浓度的不断增加（50、100、200、400 及 800mg L-1），HRMC RANTES 的表达也随之增加；选取敏感浓度 AGE-BSA（400mg L-1）进一步实验，发现随着干预时间的延长（8、16、24、48、72 h），RANTES 的表达水平也逐步升高，证实 AGE-BSA 在一定范围内可呈浓度和时间依赖性增加 HRMC RANTES mRNA 和蛋白表达。关于 AGEs 上调 RANTES 表达的机制目前尚不清楚，可能涉 及多种相互作用的细胞内信号转导。AGEs 可与其特

27、异性受体（RAGE）结合介导细胞学效 应，引起多种细胞因子的产生和释放，如 IL-1、IGF-1、TNF-、TGF-、PDGF 等，而 RANTES 发挥其生物学功能也与多种细胞因子相关。 Gong 等8提出 TNF- 呈时间和浓度依赖性增 加邻近小管上皮细胞 RANTES mRNA 和蛋白的表达。Wang 等3研究发现，蛋白尿诱导的肾 脏间质纤维化可能是通过 TGF- 激活 RANTES，进而导致细胞外基质蛋白的沉积和间质纤 维化。因此，结合本实验结果，我们推测 AGEs 可能是通过 TGF- 等细胞因子途径增加 RANTES 的表达。罗格列酮是近年来开发的噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂9，它通过

28、与核内过氧化物酶增 殖体物激活受体 （peroxisome proliferatoractivated receptor gamma ，PPAR-）结合，影 响细胞内与糖代谢相关的蛋白表达或功能变化，促进葡萄糖向细胞内转运和代谢，从而提 高胰岛素敏感性降低血糖。本实验结果显示罗格列酮与 AGE-BSA 共同干预 HRMC 48h 后， RANTES 受 AGE-BSA 诱导表达增加的效应明显被部分抑制，且抑制程度与罗格列酮浓度 呈正相关。这与夏琼等10研究发现罗格列酮能抑制子宫内膜基质细胞 RANTES 的转录和翻 译有相似之处。PPAR- 是核激素受体超家族中的成员之一，在脂肪组织中表达最多

29、，在体 外培养的系膜细胞中也有表达11。有研究证明，AGEs 与其受体作用后可降低大鼠皮质 PPAR-mRNA 的表达12，而罗格列酮可以抑制 RAGE 表达增加13。夏琼等10研究发现子宫 内膜基质细胞也表达 PPAR-，在体外实验中 PPAR- 与受体激动剂（罗格列酮）结合后可 以减少 RANTES 的生成。因此，我们推测罗格列酮可能通过降低 AGEs 与其受体作用，激 活 PPAR- 通路，抑制 AGEs 诱导的 HRMC RANTES 的表达和分泌。本研究运用罗格列酮与 AGE-BSA 共同干预 HRMC，观察到口服降糖药罗格列酮可抑 制 AGEs 诱导的 HRMC RANTES mR

30、NA 和蛋白表达的增加，进一步提示罗格列酮可降低 RANTES 水平，但其具体机制尚待进一步研究。参考文献1 Friedman EA. Renal syndromes in diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 1996 Jun;25(2):293-324 2 Ruster C, Wolf G. The role of chemokines and chemokine receptors in diabetic ne-phropathy. Front Biosci. 2008 Jan 1; 13: 944-553 Wang SN, Lapage J

31、, Hirschberg R. Role of glomerular ultrafiltration of growth factors in progressive interstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Kidney Int. 2000 Mar; 57(3): 1002-144 Vielhauer V, Berning E, Eis V, et al. CCR1 blockade reduces interstitial inflammation and fibrosis in mice withglomerulosclerosis a

32、nd nephrotic syndrome. Kidney Int. 2004 Dec; 66(6):2264-785 Joo KW, Hwang YH, Kim JH, et al. MCP-1 and RANTES polymorphisms in Korean diabetic end-stage renal disease. J Korean Med Sci. 2007 Aug; 22(4):611-56 Prasad P, Tiwari AK, Kumar KM, et al. Association of TGFbeta1, TNFalpha, CCR2 and CCR5 gene

33、polymorphisms in type-2 diabetes and renal insufficiency among Asian Indians. BMC Med Genet. 2007 Apr 12; 8:207 李世云, 孙子林, 刘乃丰等. AGEs-BSA 对人肾系膜细胞分泌 RANTES 的影响初探. 东南大学学报（医学版）. 2003, Nov; 22(6): 363-3658 Gong R, Rifai A, Tolbert EM, et al. Hepatocyte growth factor ameliorates renal interstitial inflamm

34、ation in rat remnant kidney by modulating tubular expression of macrophage chemoattractant protein-1 and RANTES. J Am Soc Nephrol. 2004 Nov;15(11):2868-819 Balfour JA, Plosker GL. Rosiglitazone.Drugs. 1999, 57(6): 921-93010XIA Qiong, ZHAO Dong, HUANG Lihong. PPAR-2gamma Inhibits Endometrial Stromal

35、Cell Transcription and Translation of RANTES in Vitro. Medical Journal of Wuhan University.2007, Nov; 28(6): 719-2111 Asano T, Wskisaka M, Yoshnari M, et al . Peroxisome proliferator-2activated receptor gamma1( PPARgamma1 ) expresses in rat mesangial cells and PPAR gamma agonists modulate it s diffe

36、rentiation. Biochim Biophys Acta, 2000, 1497: 1482154.12YU Xiaoyan, LI Cai, MIAO Chunsheng, et al. Effects of advanced glycation end products on peroxisomeproliferator-activated receptor-mRNA expression in rat renal cortex. Journal of J ilin University (MedicineEdition). 2007, Jan; 33(1): 95-9713Mar

37、x N, Walcher D, Ivanova N, Rautzenberg K, et al. Thiazolidinediones reduce endothelial expression of receptors for advanced glycation end products. Diabetes. 2004 Oct; 53(10): 2662-2668Rosiglitazone inhibit the upregulation of regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted induced b

38、y advanced glycosylation end products in human renal mesangial cellsZhou Li，MA Li，Sun ZilinDepartment of Endocrinology，ZhongDa hospital，SouthEast University，Nanjing（210009）AbstractObjectives: To investigate the effects of advanced glycosylation end products (AGEs) on theexpression of chemokine RANTE

39、S (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) in the cultured human renal mesangial cells (HRMC) and the effect of rosiglitazone. Methods: AGEs were prepared by incubation of bovine serum albumin(BSA) with high concentration of glucose at37 for conditioned time in vitro. HRMC was cultured in the presence of AGE-BSA (glucose at 50 mmolL-1) or together with rosiglitazone. RANTES m