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1、精品论文Zn2+依赖型组蛋白去乙酰化酶在糖尿病肾 病大鼠中的表达及作用王晓杰，王宇芃，李香，王平安，许卉妍，李凤丽，易凡5（山东大学医学院，济南 250012）摘要：目的：研究 Zn2+依赖型组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDAC）在糖尿病 肾病大鼠肾脏中表达及作用。方法：Western-blot 检测 HDAC 各个亚型在糖尿病肾病大鼠以 及高糖刺激下肾脏细胞中的表达。通过慢病毒载体 shRNA 抑制 HDAC4 的表达并使用流式 细胞技术检测 HDAC 低表达对高糖引起足细胞凋亡的影响。结果：HDAC2，HDAC4，HDAC510在糖尿病肾病组大鼠肾脏中表达增
2、加，与正常组相比有显著性差异(p0.05)。以终浓度为40mM 高糖刺激足细胞后发现高糖组 HDAC4 的表达显著增加，与正常对照组以及渗透压对 照组相比有显著性差异(p0.05)。同时以慢病毒载体 shRNA 抑制 HDAC4 的表达，发现高糖刺激下，HDAC4 低表达组比正常组细胞凋亡率显著降低。结论：HDAC 在糖尿病肾病中发挥作用并且可能与 HDAC4 高表达导致的足细胞凋亡有关。15关键词：药理学；糖尿病肾病；组蛋白去乙酰化酶；足细胞；凋亡中图分类号：R966The expression of Zn2+-dependent histone deacetylase in diabeti
3、c rats20WANG Xiaojie, WANG Yupeng, LI Xiang, WANG Pingan, XU Huiyan, LI Fengli,YI Fan(Medicine school, Shangdong University, JiNan 250012)Abstract: Histone deacetylase inhibitor shows great promise to protect renal disease，especially inanti-inflammation and anti-oxidation stress. However, the role o
4、f each isoform of HDAC in the25pathogenesis of diabetic nephropathy keep unclear. In the present study, we investigated the expression patterns of HDACs in kidney of rats with diabetic nephropathy (DN) and found that the expression of HDAC2, HDAC4 and HDAC5 was significantly enhanced in DN. In in vi
5、tro study,high Glucose (HG) induced HDAC4 expression and gene silencing of HDAC4 by shRNAameliorated podocyte apoptosis. Taken together, our studies indicate that HDAC4 play an30important role in the pathogenesis of DN and the development of HDAC inhibitors with improved specificity is required to d
6、evelop effective therapeutic strategies to treat DN.Keywords: Pharmacology; DN; HDAC; Podocyte; Apoptosis1 引言35糖尿病肾病是一种重要的糖尿病微血管并发症，是终末期肾病的重要成因，也是导致糖 尿病患者死亡的重要因素1。糖尿病肾病的发病机制复杂，这其中包括糖脂代谢紊乱、血流 动力学的改变、氧化应激、致炎因子和致纤维化因子的产生以及糖基化终末产物的积聚等。 这些致病因子引起的肾脏细胞信号通路的改变是导致肾小球损伤的重要原因。表观遗传学机制参与到细胞的生长、分化、凋亡等重要生理学过程中。这其中
7、包括磷酸40化过程、乙酰化过程、microRNA 的调控等。其中乙酰化水平的改变在疾病的病理生理机制 中的调控作用越来越引起重视，尤其是药物治疗方面。以改变组蛋白乙酰化水平为目的的药 物已经运用在肿瘤治疗中并通过美国 FDA 批准上市。HDAC 与组蛋白乙酰化酶（Histone基金项目：教育部高等学校博士点专项科研基金新教师基金课题（20090131120081） 作者简介：王晓杰，（1989-），男，博士生，糖尿病肾病。 通信联系人：易凡，（1972-），男，教授，分子药理学。E-mail: fanyi- 7 -acetyltransferases，HAT）相互作用调控组蛋白乙酰化水平的平衡
8、。有文献报道，1750 多种蛋白存在乙酰化位点2，因此通过 HDAC 与 HAT 对蛋白乙酰化水平的调控是重要的生化反45应。迄今为止共发现 18 个 HDAC 亚型，HDAC 依据其与酵母中转录抑制因子同源性分类， I 类 HDAC 与酵母中 RPD3 序列同源性高，主要分布在细胞核内，包括 HDAC1，HDAC2， HDAC3，HDAC8。II 类 HDAC 序列与酵母 HDA1 同源性高，II 类 HDAC 受信号通路影响， 穿梭在细胞核与细胞质之间。II 类的 HDAC 又进一步分为 IIa 与 IIb 两种亚型，IIa 类 HDAC 包括 HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC
9、9，IIb 类 HDAC 包括 HDAC6，HDAC10。II 类50HDAC 往往与 I 类 HDAC 结合在一起产生去乙酰化作用。III 类 HDAC 与酵母中 NAD+依赖 型 Sirtins 同源性高，又命名为 SIRT1-7，SIRT1-7 是 NAD+依赖型 HDACs。HDAC11 与 I 类 HDAC 有相似性，但是序列同源性较低，所以归为 IV 类 HDAC3, 4。I、II 和 IV 类为 Zn2+ 依赖型 HDACs。小分子 HDAC 抑制剂主要作用在于降低 Zn2+依赖型 HDACs 的活性。本实 验主要研究 Zn2+依赖型 HDACs 在糖尿病肾病中的作用。HDAC
10、抑制剂对于糖尿病肾病的保55护作用已有报道，Gilbert RE 等人发现 HDAC 抑制剂 Vorinostat 可以抑制糖尿病造成的肾脏 肥大，这种抑制作用与 EGF-EGFR 信号通路有关5。最近有文献报道长时间的 Vorinostat 干 预能够降低蛋白尿，同时伴随着 eNOS 的表达降低，提示 HDAC 在糖尿病肾病发病中起到 重要作用，并且可能与 eNOS 表达调控有关6。大量研究集中在高糖引起信号通路的改变对于系膜细胞的损伤上，近期有研究表明足细60胞损伤在糖尿病肾病发病早期起到了关键作用。足细胞凋亡导致足细胞数量减少可能是糖尿 病肾病发病的重要因素，也是糖尿病肾病早期蛋白尿产生
11、的关键因素7。本研究表征了 Zn2+依赖型 HDAC 在糖尿病肾病大鼠模型中的表达。并构建了 HDAC4 低表达足细胞系，通过流式细胞仪法检测了 HDAC4 低表达对于高糖引起足细胞凋亡的影 响。652 材料与方法2.1 试剂HDAC1, HDAC2, HDAC8 抗体(abcam, 公司), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6 和 HDAC7 抗体（Proteintech group 公司）；链脲佐霉素（STZ，Sigma 公司）；D-glucose（Sigma 公司）；细胞凋亡试剂盒（碧云天公司）；免疫组化试剂盒（碧云天公司）；慢病毒载体包70装 shRNA（广东 Bio
12、wit 公司，shRNA 序列：5-CCGTGTAAACCACTCAACTC ATCTT-3 )。2.2 动物模型Wistar 大鼠，200250g，雄性，山东大学实验动物中心提供。糖尿病肾病模型组（DN 组）大鼠尾静脉注射 STZ，正常对照组（NC 组）大鼠尾静脉注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲 液。注射前禁食 12 小时，72 小时后大鼠尾静脉取血，测血糖，以血糖高于 16.7mmol/L 为75DN 模型建立成功。第 12 周末收集各组大鼠 24h 尿，离心，取上清液，-20保存。动物称 重，麻醉，取血，离心，取血清，-80保存。摘取肾组织，部分去包膜，4%甲醛固定；另 外部分分离肾皮质与肾
13、髓质，-80保存。2.3 细胞培养足细胞培养在含 10%胎牛血清，10 U/mL 重组小鼠 IFN- 的 RPMI-1640 培养液中。在8033，5% CO2 孵箱中培养传代，将传代的足细胞转入 37，无干扰素 的培养液中，培养8590951001014 d 诱导分化。将细胞分为正常对照组：正常培养。高糖组： D-葡萄糖 20mM，40mM 干预培养。渗透压对照组：甘露醇 40 mM 干预培养作为渗透压对照。干预 24 h 后 收集细胞。2.4 PAS 染色石蜡切片脱蜡至水； 1% 过碘酸氧化 15 min, 蒸馏水洗；无色品红加盖避光染 30 min， 不经水洗， 擦净组织旁多余染液；重亚
14、硫酸水浸 1 min,水洗 2 min5 min；Harris 苏木素复 染 2 min 左右，水洗；1% 盐酸-酒精分化，流水冲洗；1% 氨水中返蓝 1min；流水冲洗； 脱水，透明，树脂封片。2.5 免疫印迹（Western-blot）动物肾脏皮质与处理结束的细胞通过 RIPA 裂解液裂解，超声粉碎 12s，10000r/min 离 心 10min，取裂解液上清， Bradford 法测定蛋白浓度。加上样缓冲液并于沸水中煮 5min 后 以 SDS-PAGE 分离，电泳完毕后胶上的蛋白电转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉封闭，与 待测目的蛋白的特异性抗体孵育杂交，最后在 X 光片自显
15、影显示结果，扫描并分析结果的 光密度值。2.6 细胞凋亡的检测Annexin-V 和 PI 双染及流式细胞计数检测凋亡率: 调整待测细胞浓度为 5105 到 1106 个/ml，取 1ml 细胞，1000r/min，4离心 10min，弃上清，加入 1ml 冷 PBS，震荡使细胞悬 浮，1000r/min 离心，将细胞重悬于 Binding 缓冲液 200ul，加入 Annexin-V 10 ul，轻混匀， 避光，室温反应 15min，检测前加入 5ul PI，流式细胞仪检测。软件计算凋亡率。2.7 统计学处理采用 GraphPad Prism 5 统计软件进行数据处理，计量资料以 meanS
16、D 表示，采 用 t 检验或者单因素方差分析(one-way ANOVA)，P0.05 为差异具有统计学意 义。3 结果1051103.1 糖尿病肾病模型中肾脏指标的变化。DN 组与 NC 组相比大鼠血糖、尿量及尿蛋白水平都显著升高（P0.05，表 1），并且 PAS 染色可见 DN 组与 NC 组相比，肾小球肥大，基底膜增厚，糖基化严重（图 1 上）。透 视电子显微镜下可见 NC 组足细胞足突分布均匀，无融合，DN 组足突部分融合，足状突起 变成带状分布，贴于基底膜上（见图 1 下）。表 1 糖尿病肾病大鼠模型生理指标变化Table1 Clinical characteristics of
17、control and STZ-induced diabetic rats正常组 糖尿病肾病模型组 P血糖值（mM） 6.81.2 28.55.6 0.05 体重（g）451.254.1 285.621.3 0.05 尿量（ml/24h）20.25.6 210.15.6 0.05 尿蛋白量（mg/24h）4.20.6 26.03.4 0.05n 10 10注:数据表示方式为 meansSD。115120125130图 1：糖尿病模型大鼠肾脏病理形态变化。A：正常大鼠与糖尿病肾病大鼠的肾脏切片 PAS 染色。 B：正 常大鼠与糖尿病肾病大鼠的肾脏切片透射电镜图。Figure1: The morp
18、hological changes of diabetic rats. A: The PAS stain of the kidney from rats with diabetic nephropathy. B: Transmission electronic microscopy figures of kidney from rats with diabetic nephropathy.图 2：HDAC1-8 在糖尿病肾病大鼠肾脏中的表达情况。A：Western blot 检测 HDAC1-8 在糖尿病肾病大鼠 肾脏中的表达情况。 B：Western blot 检测 HDAC1-8 表达的灰
19、度值统计结果。（*表示 NC 组与 DN 组相比 差异有统计学意义）Figure2: HDAC1-8 protein levels in the kidney from rats with diabetic nephropathy. A:Western blot analysis of HDAC1-8 protein levels in the kidney from rats with diabetic nephropathy .B: Summarized data showing HDAC1-8 expression determined by Western blot. (* means
20、 statistically significant)3.2 高糖刺激下 HDAC 在系膜细胞与足细胞中的表达Western-blot 检测结果发现正常组、高糖终浓度 20mM 组、高糖终浓度 40mM 组以及甘 露醇终浓度 40mM 组中的 HDAC2，HDAC4，HDAC5 在系膜细胞中表达没有显著性差异（图3）。而高糖组足细胞中 HDAC4 均表达显著增加，与正常组对照组和渗透压对照组相比有 统计学意义(P0.05)（图 4）135140145150图 3：高糖对系膜细胞 HDAC2、HDAC4 和 HDAC5 表达的影响。A：Western blot 检测高糖对系膜细胞 HDAC2、H
21、DAC4 和 HDAC5 表达的影响。 B: Western blot 检测 HDAC2、HDAC4、HDAC5 表达的灰度值统计结果。（*表示 NC 组与 DN 组相比差异有统计学意义）Figure 3：The effect of high glucose on the regulation of HDAC2, HDAC4 and HDAC5 expression in ratmesangial cells. A: HDAC2, HDAC4 and HDAC5 expression in rat mesangial cells determined by Western blot. B: S
22、ummarized data showing HDAC2, HDAC4, HDAC5 expression determined by Western blot. (* means statistically significant).图 4：高糖对足细胞 HDAC2、 HDAC4 和 HDAC5 表达的影响。A：Western blot 检测高糖对足细胞 HDAC2、HDAC4 和 HDAC5 表达的影响。B: Western blot 检测 HDAC2、HDAC4、HDAC5 表达的灰度值统计结果。（*表示 NC 组与 DN 组相比差异有统计学意义）Figure 4：The effect
23、of high glucose on the regulation of HDAC2, HDAC4 and HDAC5 expression in ratpodocytes A: HDAC2, HDAC4 and HDAC5 expression in rat podocytes determined by Western blot. B: Summarized data showing HDAC2, HDAC4, HDAC5 expression determined by Western blot. (* means statistically significant)1553.3 慢病毒
24、介导的 HDAC4 低表达细胞系的建立以慢病毒为载体的 shRNA 感染足细胞，药物筛选后，得到 HDAC4 低表达的稳转细胞 系。Western-blot 检测结果显示 HDAC4 在 shRNA 感染组表达显著降低，与正常组以及阴性 对照组相比有统计学意义(P0.05)（图 5A）。3.4 基因沉默 HDAC4 对高糖刺激下足细胞凋亡的影响Annexin-V、PI 双染，流式细胞技术法检测，结果显示高糖 40mM 刺激足细胞 24 小时 可以引起足细胞凋亡率显著增高。在高糖刺激下，HDAC4 低表达组足细胞组凋亡率降低， 与正常足细胞组相比有统计学意义(P0.05)（图 5B）。16016
25、5170175180185190图 5：基因沉默 HDAC4 对足细胞凋亡的影响。A：通过转染 shRNA-HDAC4 后 HDAC4 的表达。B：流式 细胞术检测基因沉默 HDAC4 对高糖诱导的足细胞凋亡的影响。(*表示高糖刺激组与正常组相比差异有统计 学意义，#表示高糖刺激下正常细胞组与 shRNA 组相比差异有统计学意义）。Figure 5：The effect of gene silencing of HDAC4 on podocyte apoptosis. A. Representative Western blot geldocuments and summarized data
26、 showing that efficiency of gene silencing of HDAC4 by shRNA-HDAC4 transfection. B. Summarized data showing podocyte apoptosis determined by flow cytometric analysis. (* means statistically significant compared with Normal group and HG group. # means statistically significant compared with HG-treate
27、d normal group and HG-treated shRNA group)4 讨论本研究通过检测 Zn2+依赖型 HDAC 在糖尿病肾病模型大鼠中的表达，发现糖尿病肾病 模型大鼠肾脏中 HDAC2、HDAC4、HDAC5 表达显著增加，结果提示我们 HDAC2、HDAC4、 HDAC5 可能参与到糖尿病肾病的发生发展。Noh H 等报道 NRK-52E 细胞中 HDAC2 在 TGF- 的刺激下活性升高，并且伴随活性氧 ROS 水平的升高，提示 HDAC2 可能在糖尿病引起 的氧化应激中发挥作用8。Gilbert RE 报道在糖尿病肾病的发病过程中，HDAC 可能与 EGF-EGFR
28、 信号通路有关。HDAC 抑制剂 Vorinostat 干预可以降低 EGFR 的表达，从而抑制 糖尿病引起的肾脏肥大，HDAC 可能与 EGFR 的转录因子结合，抑制了 EGFR 的表达增高。 长期的 HDAC 抑制剂的作用会降低糖尿病引起的尿蛋白量，这种降低会伴随着 eNOS 表达 的降低。在 eNOS-/-小鼠模型中，长期的 Vorinostat 干预并没有对尿蛋白量有所改善，因此 HDAC 可能通过增强 eNOS 信号通路来影响糖尿病肾病的发生6。这些报道多集中在 HDAC 抑制剂对糖尿病引起的肾脏肥大的治疗以及 HDAC 在糖尿病引起的氧化应激中的作用。本 研究首次发现高糖刺激下 H
29、DAC4 在足细胞中表达显著升高，并且对足细胞的凋亡有促进作 用，提示 HDAC4 可能与糖尿病引起的足细胞凋亡，进而导致的尿蛋白的增加有关。高糖刺激下 HDAC4 在足细胞中表达明显增加，而系膜细胞 HDAC 无明显变化，提示 高唐刺激下 HDAC4 在肾脏细胞的表达变化具有细胞特异性。通过细胞流式技术检测发现 HDAC4 低表达可以抑制由高糖引起的足细胞凋亡，表明 HDAC4 参与到高糖引起的足细胞 的损伤过程。足细胞的凋亡对于糖尿病肾病的发生有着重要的作用，足细胞是肾小球过滤屏 障中重要组成部分，在维持肾小球滤过屏障的功能, 调节超滤系数以及保持肾小球基底膜的 正常形态中起重要作用。足细
30、胞数量或平均密度减少是糖尿病肾病肾小球硬化发生发展的启 动因素，而足细胞凋亡是足细胞细胞减少重要原因之一9-11。本实验结果发现高糖刺激下 HDAC4 低表达组足细胞凋亡率比正常组明显降低，可能与 HDAC4 对于促凋亡基因表达的 调控有关。HDAC4 作为 IIa 类 HDAC 受信号调节穿梭在细胞核与细胞质之间，作用底物很 多，不仅包括组蛋白，还包括转录因子 FOXO、MEF2、 14-3-3 蛋白等。HDAC4 表达的改 变或者活性的改变影响下游蛋白活性细胞活动，进而起到调节细胞活动的作用。Mihaylova195200205MM 曾报道 HDAC4 的活性升高会导致下游蛋白 FOXO1
31、 乙酰化水平的降低，FOXO1 的乙酰化水平降低会导致与 DNA 序列结果更加容易，从而促进了 FOXO1 下游蛋白的表达12，因 此 HDAC4-FOXO 信号通路在细胞活动的调节起到了很重要的作用。FOXO1 在足细胞中会 介导促凋亡基因的表达，例如 Bim、FasL 及 TRAIL 等11，因此高糖引起的 HDAC4 的表达 增加以及足细胞的凋亡可能会与 HDAC4-FOXO1 信号通路的增强有关。综上所述，HDAC2，HDAC4，HDAC5 在糖尿病肾病肾脏组织中表达较正常组显著增 加，在高糖刺激下，HDAC4 在足细胞中表达显著升高。HDAC4 低表达会缓解高糖引起的 足细胞的凋亡。
32、这些结果提示我们 HDAC4 参与到糖尿病肾病的发生，并且与促进足细胞凋 亡有关。参考文献 (References)2102152202252301 Pozzi A, Zent R, Chetyrkin S, et al. Modification of collagen IV by glucose or methylglyoxal alters distinct mesangial cell functionsJ. Journal of the American Society of Nephrology : JASN, 2009, 20(10): 2119-2125.2 Gnad F, R
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