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1、小鼠 BPI N 端功能基因片段的克隆及其表达产物在胞内杀菌作用的研究1李丽，冯颖，吕喆，孔庆利，刘振龙，赵冬，高燕，王炜*，安云庆*首都医科大学免疫学系，北京（100069）E-mail：anyunq摘要：目的：克隆小鼠 BPI36-259基因片段，转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。方法： 采用生物信息学方法，构建PUC57-muBPI1-281 质粒；PCR 扩增获得muBPI36-259 基因片段，制备 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质 粒； 采用电穿孔 法将上述重组 质粒转染 RAW264.7 细胞 ， Western-blot法检测目的蛋白在胞内的表达；
2、建立胞内杀菌实验模型，检测muBPI36-259目的蛋白对 胞内寄生菌（伤寒杆菌）的杀伤作用。结果：muBPI36-259目的蛋白在RAW264.7细胞内成功表达， 对胞内寄生菌G- 伤寒杆菌具有杀伤作用。结论：成功克隆了小鼠BPI36-259 基因片段，转染 RAW264.7细胞获得具有生物学活性目的抗菌蛋白。 关键词：杀菌/渗透性增强蛋白；RAW264.7细胞；伤寒杆菌中国图书分类号：R392杀菌/渗透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是广泛存在于人、牛、 猪等多种哺乳动物多形核中性粒细胞中的一种 55KD 的阳离
3、子抗菌蛋白1,2。因其兼备中和内毒素 和杀伤革兰氏阴性菌(GNB)双重作用而受到关注3。我们成功克隆了人 BPI 基因和人 IgGFc 基因， 制备了 AAV2-BPI-Fc1 重组病毒，将其转染小鼠两周后，可使小鼠对致死量 E.coli 感染攻击产生 良好的保护作用4,5。人 BPI 和 Fc1 为异源性蛋白，可引发小鼠免疫应答产生相应抗体阻断目的 抗菌蛋白的杀菌作用。因此，无法长期观察基因导入小鼠对 GNB 感染的抵抗作用，难以确定抗感 染基因转染能否为临床感染高危人群提供一种有效预防 GNB 感染的方法和途径。为此，本研究拟克隆编码小鼠 BPI 功能片段的基因（muBPI36-259）和
4、编码小鼠 IgGFc 基因（Fc）， 制备 AAV2-muBPI36-259-Fc1 重组病毒载体，并通过观察目的基因产物在小鼠体内能否引起免疫应 答和基因转染小鼠对致死量 E.coli 感染攻击保护作用持续的时间，以确定人 BPI-Fc1 嵌合基因转 染在临床感染高危人群中应用的可行性。采用生物信息学方法对小鼠 BPI 和人 BPI 基因进行同源分析，预测小鼠 BPI 功能片段，获得 muBPI36-259 基因片段，构建 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒。然后采用电穿孔法将上述重组质 粒转染 RAW264.7 巨噬细胞，通过胞内杀菌试验6检测目的抗菌蛋白的杀菌活性
5、。1. 材料与方法1.1 材料BamH、Kpn 限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，Go Taq polymerase 购自 Promega 公司；Qiagen 胶 纯化回收试剂盒，购自北京欣经科生物技术有限公司；Tiangen 质粒小提试剂盒，购自天根生化科 技北京有限公司；威格拉斯大提质粒试剂盒购自威格拉斯生物技术北京有限公司；伤寒杆菌（50071）为本室保存；RAW264.7 细胞为小鼠单核巨噬细胞系（ATCC Number：CRL-2278）， 购自中国协和医科大学细胞中心；绿色荧光增强蛋白表达质粒 pEGFPN1 为本室保存；pcDNA3.1 (+) 质粒购自 Invitrogen
6、公司；兔抗鼠 BPI 多克隆抗体为本室制备、羊抗兔 IgG 单克隆抗体购自华美 生物工程公司。1本课题得到教育部博士学科点专项科研基金（20040025002）和北京市自然科学基金项目（7082016）资助。- 2 -1.2 方法1.2.1 小鼠 BPI 功能片段的预测采用 ClustalW 软件对 BALB/c 小鼠和人 BPI 氨基酸序列进行比对，结果显示小鼠 BPI 氨基酸 序列与人 BPI 氨基酸序列 53%相同，相似度高达 71（图略）。采用 SMART 软件预测分析 BALB/c 小鼠 BPI 氨基酸结构域，发现小鼠与人 BPI 结构域高度相似，其 N 端第 127 位氨基酸为信号
7、肽 序列，N 端第 36259 位氨基酸是具有中和内毒素和杀菌作用的功能片段，C 端第 274478 位氨 基酸序列与 N 端结构域氨基酸序列相似度小于 20%（表略）。由上海生工生物工程技术服务有限 公司化学合成小鼠 BPI1-281 基因片段，构建 PUC57-BPI1-281 质粒。1.2.2 小鼠 BPI36-259 目的基因片段的扩增以 PUC57-BPI1-281 质粒 DNA 为模板，在引物 P1（5 cgg ggt acc atg atc tcc cag aag ggt ctg gac ttc g 3 ）和引物 P2（5 cgc gga tcc tta gtg tcc cct
8、cca gaa aaa ctc3）作用下，采用 PCR 法扩增编码小 鼠 BPI36-259 抗菌蛋白的 muBPI36-259 基因片段。反应条件为：95预变性 2min，95变性 45s, 59.8退火 45s，72延伸 51s，72充分延伸 5min，410min 终止反应，30 个循环。1.2.3pcDNA3.1（+）-muBPI36-259 重组质粒的构建和鉴定用 BamH 与 Kpn 分别双酶切 pcDNA3.1 (+)质粒和 muBPI36-259 基因片段。取上述酶切产物以 3：1 比例混合后，通过连接反应构建 pcDNA3.1（+）- muBPI36-259 重组质粒。将 p
9、cDNA3.1（+）-muBPI36-259 重组质粒转化 E.coli DH5，挑选阳性克隆菌小提质粒，进行酶切鉴定和测序分析。1.2.4pEGFP-N1 对 RAW264.7 细胞的转染及其条件优化 采用电穿孔法将绿色荧光增强蛋白表达质粒 pEGFP-N1 转染 RAW264.7 细胞。取不同剂量pEGFP-N1 质粒 DNA（5、10、15、20、25、30g）分别与 0.2mlRAW264.7 细胞（2107 个/ml）悬液在 Eppendorf 管中混匀，4静置 10 分钟后将管内细胞悬液置于电转杯中，用不同电压和脉 冲时间进行电转染条件优化选择。然后将细胞混合液加入六孔板中置于 C
10、O2 孵箱中培养，并在培 养第 24h，48h 和 72h 在荧光和普通光学显微镜下观察各孔细胞计数转染率。1.2.5pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒对 RAW264.7 细胞的转染实验分为三组：pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒转染实验组、pcDNA3.1 (+)空质粒转染对照 组和空白细胞对照组。取 0.2ml RAW264.7 细胞悬液（2107 个/ml）和最适剂量（20g）质粒 DNA 置于 Eppendorf 管中混匀；4静置 10 分钟取管内细胞悬液置于电转杯中，选择最佳电压 和脉冲条件电击穿孔；将杯中细胞混合液置于六孔板中，各孔
11、补加 2ml 改良 RPMI1640 培养液 后，将六孔板置于 CO2 孵箱 37培养 48 小时，用于伤寒杆菌感染和细胞内目的蛋白的检测。1.2.6muBPI36-259 目的蛋白在 RAW264.7 细胞内的表达取 15l pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒转染后培养 48 小时的 RAW264.7 细胞裂解液与 15l2SDS 电泳上样缓冲液混匀后（10l）上样；以兔抗鼠 BPI 抗血清（1：1000 稀释）作为一抗， 以 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体（1：500 稀释）为二抗；Western-blot 检测 RAW264.7 细胞内 muBPI36-259
12、 目的蛋白的表达情况。1.2.7伤寒杆菌对 RAW264.7 细胞的感染和胞内菌落计数取 50l 伤寒菌液（4105 个/ml）分别加入六孔板培养的 RAW264.7 细胞、pcDNA3.1 (+)空质粒转染的 RAW264.7 细胞和 pcDNA3.1(+)-muBPI36-259 重组质粒转染的 RAW264.7 细胞中；将六孔板 1000rpm 离心 10 分钟后，37培养 25 分钟，弃上清，PBS 洗 3 次；各孔加入 2ml 改良 RPMI1640 培养液（庆大霉素终浓度为 100g/ml），37培养 1 小时后弃上清，再加入 2ml 改良 RPMI1640 培养液（庆大霉素终浓度
13、 15g/ml），37培养过夜；吸弃六孔板中培养上清液，用0.1%的吐温 20 裂解 RAW264.7 细胞，采用平板倾注法检测细胞裂解液中菌落数。1.2.8伤寒杆菌在电穿孔前/后 RAW264.7 细胞内生长情况的检测将正常 RAW264.7 细胞和电穿孔前后培养 1 天，2 天，3 天的 RAW264.7 细胞分别与伤寒杆菌 共育 25 分钟，洗涤去除胞外细菌后继续培养，并在继续培养的第 2h、4h、8h、16h 取一定量细胞 裂解，采用平板倾注法检测裂解液中菌落数，观察伤寒杆菌在 RAW264.7 细胞内的生长情况。2. 结果2.1 小鼠 BPI36-259 基因片段的 PCR 鉴定以
14、PUC57-BPI1-281 质粒 DNA 为模板， P1/P2 为引物，采用 PCR 法扩增小鼠 BPI36-259 基因片 段。取 PCR 产物 5l 电泳后在琼脂糖凝胶 500bp750bp 间可见一条粗大的 DNA 条带（669bp）， 与实验预期结果相符（图略）。2.2pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒酶切和测序鉴定从 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒转化阳性克隆菌中提取质粒 DNA，用 BamH和 Kpn酶切质粒 DNA 后，电泳鉴定结果如图 1A/B 所示：酶切前重组质粒 DNA 在凝胶上出现一 条与预期结果大小相符的条带（609
15、7bp）；酶切后质粒 DNA 在凝胶上出现一条与 pcDNA3.1 (+)质 粒大小（5428bp）相符的条带和一条与小鼠 BPI36-259 基因片段大小（669bp）相符的条带。双酶切 鉴定后重组质粒用引物 T7 测序，结果与基因库中小鼠 BPI36-259 基因序列完全相同（图略）1 2(B)12- 3 -7000bp5500bp3500bp2000bp1000bp500bp重组质粒重组质粒 DDNNAA(66009797bpbp)重组质粒重组质粒 DDNNAA(66009797bpbp)(A)pcDNA3.1(+)- muBPI 36-2597000bp5500bp3500bp2000
16、bp1000bp500bp(554428b28bp)p)(554428b28bp)p)(554428b28bp)p)(5555444428b28b28b28bp)p)p)p)ppppppppppppppppppppccccccccccccccccccccDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNA3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3.11111111111111111111(+)(554428b28bp)p)(554428b28bp)p)(554428b28bp)p)(5555444428b28b28b28bp)p
17、)p)p)pppppppppppppppppppppcccccccccccccccccccccDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNA3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3.111111111111111111111(+)(554428b28bp)p)(554428b28bp)p)(554428b28bp)p)(5555444428b28b28b28bp)p)p)p)ppppppppppppppppppppccccccccccccccccccccDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDN
18、DNDNDNDNDNA3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3A3.11111111111111111111(+)pcDNA3.1(+)(666666669bp)9bp)9bp)9bp)(666666666666666666666666666666669bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)(666666669bp)9bp)9bp)9bp)(666666666666666666666666666666669bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp
19、)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)(666666669bp)9bp)9bp)9bp)(666666666666666666666666666666669bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)9bp)muBPI 36-259DNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAA质粒质粒DNDNDNDNAAAA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNA
20、AAADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAA质粒质粒DNDNDNDNAAAA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAA质粒质粒DNDNDNDNAAAA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAADNADNADNADNA质粒质粒DNDNDNDNAAAA图 1 pcDNA3.1(+)-m
21、uBPI36-259 重组质粒的酶切鉴定结果Fig.1 Restrictive enzyme digestion of the recombinant pcDNA3.1(+)-muBPI36-259Note: 2A: 1. DNA Marker；2. pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 recombinant plasmid2B: 1. DNA Marker；2. pcDNA3.1 (+) and muBPI36-259 plasmid2.3pEGFP-N1 质粒对 RAW264.7 细胞最佳转染条件的选择参照实验方法 1.2.4，在电压 170v，脉冲 15ms 电转染条件下，
22、培养 48 小时的 RAW264.7 细胞 在荧光显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的细胞数最多（图略）。在荧光和普通光学显微镜下分别计 数同一视野中表达绿色荧光蛋白的细胞数和总细胞数（图 2），根据电转染率=（发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数）100% 公式计数，pEGFP-N1 质粒对 RAW264.7 细胞的转染率为 35%，能够满足实验要求。- 7 -A Cells transfected by pEGFP-N1 observed with fluorescence microscopeB Cells transfected by pEGFP-N1 observed with ligh
23、t microscope图 2 同一视野荧光和普通光学显微镜下 RAW264.7 细胞数Figure.2 The number of RAW264.7 cells under the fluorescence and ordinary microscope in one scope2.4 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒对 RAW264.7 细胞的转染和目的蛋白的检测取最佳条件下转染目的基因的RAW264.7细胞，采用Western-blot方法检测胞内muBPI36-259目的 蛋白的表达情况。结果如图3所示：pcDNA3.1(+)-muBPI36-259重组质粒转
24、染组细胞裂解液在泳道上 出现一条实验预期的相对分子量约为29KD的条带；pcDNA3.1(+)质粒转染组细胞裂解液在泳道上 没有任何条带出现。上述所见表明：小鼠BPI36-259目的蛋白在RAW264.7细胞中得到表达。1 2 3150KD95KD72KD55KD43KD150KD95KD72KD55KD43KD34KD26KD17KD34KD26KD17KD24.9KD图 3 Western-blot 检测结果Fig.3 Western-blot resultNote：1. Prestained protein molecular weight marker；2. Cell lysate o
25、fRAW264.7 cells transfected into pcDNA3.1(+)；3. Cell lysate of RAW264.7 cells transfected into pcDNA3.1(+)-muBPI36-2592.5 伤寒杆菌对电穿孔后 RAW264.7 细胞的感染及其在细胞内的生长情况伤寒杆菌在 RAW264.7 细胞内的生长情况如图 4 所示，电穿孔后培养 1 天组各时间点细胞裂解 物中只有极少量细菌生长，提示电穿孔后培养 1 天的 RAW264.7 细胞尚未恢复吞噬功能。电穿孔 后培养 2 天组各时间点细胞裂解物中均检出细菌，其数量随培养时间的延长而增加，在第
26、16 小时每个平皿菌落数约为 200 左右。电穿孔后培养 3 天组各时间点细胞裂解物中细菌数与电穿孔后培养 2 天组相比明显增多，而此时目的基因转录水平表达较 2 天组有所下降。电穿孔后培养 2 天组 RAW264.7 细胞与正常组 RAW264.7 细胞相比，洗涤后培养各时间点胞内菌落数虽略有下降，但 无统计学意义，提示电穿孔后培养 2 天组 RAW264.7 细胞的吞噬功能已基本恢复，能够保证胞内 杀菌实验的正常进行。因此本实验选择电穿孔后培养 2 天，洗涤后继续培养 16 小时的 RAW264.7 细胞用来检测 muBPI36-259 目的蛋白对细菌的杀伤作用。250200CFUs /
27、plate1501001 day1 day2 days3 days2 days3 days5002h 4h 8h 16hTime图 4 伤寒杆菌在电穿孔后培养不同时间组 RAW264.7 细胞中各时间点的生长情况Figure.4 The multiplication of Salmonella typhi in RAW264.7 cells after electroporation in different time2.6 RAW264.7 细胞内 muBPI36-259 目的蛋白对伤寒杆菌的杀伤作用目的蛋白对胞内伤寒杆菌的抑杀作用如图 5 所示：正常对照组 RAW264.7 细胞内菌落数与
28、 pcDNA3.1(+)空载体质粒转染对照组 RAW264.7 细胞内菌落数大致相同（130-140CFU/平皿）； pcDNA3.1(+)-muBPI36-259 重组质粒转染实验组 RAW264.7 细胞内菌落数（80-90CFU/平皿）明显低 于上述对照组细胞内菌落数（p0.05）；与对照组相比，实验组目的蛋白对伤寒杆菌的抑杀率高达pCFUs /plate37%。上述结果证实：在 RAW264.7 细胞内表达的 muBPI36-259 目的蛋白对胞内寄生菌G-伤寒杆 菌具有杀伤作用。e t al/sUCFnormal cells cells transfectedcells transf
29、ected by by p cDNA3.1(+) p cDNA3.1(+) -BPI36 -normal cells cells transfected by p cDNA3.1(+)cells transfected by p cDNA3.1(+) -BPI36 -259图 5 小鼠 BPI36-259 目的蛋白对胞内寄生菌（伤寒杆菌）的抑杀作用Fig 5. Inhibition of Mouse BPI36-259 to the intracellular Salmonella typhi3讨论本研究根据Andreas等报道的小鼠BPI基因序列7，采用生物信息学方法对Balb/c小鼠BPI
30、和人 BPI氨基酸序列同源性和结构域进行比较，结果发现Balb/c小鼠BPI N端第36259位氨基酸组成的 结构域与人BPI N端第19193位氨基酸组成的结构域高度相似，提示小鼠BPI N端第36259位氨基 酸组成的蛋白具有杀伤GNB的作用。根据上述预测结果，合成小鼠BPI1-281基因片段，成功构建了 PUC57-BPI1-281质粒；以该质粒DNA为模板，采用PCR法扩增获得小鼠BPI36-259基因片段；在此基 础上成功构建了pcDNA3.1(+)-muBPI36-259重组质粒；采用电穿孔法将上述重组质粒转染小鼠单核/ 巨噬细胞系RAW264.7细胞后，继续培养48h使RAW26
31、4.7细胞恢复电穿孔造成的损伤，和目的基因 产物高水平表达时，取细胞裂解液采用Western-blot 方法检测证实小鼠BPI36-259 目的蛋白在 RAW264.7细胞内成功表达。取目的基因转染后继续培养48小时的RAW264.7细胞与伤寒杆菌共育25分钟，洗涤后继续培养16h取一定量细胞裂解液，采用平板倾注法检测发现：小鼠BPI36-259基因 转染组RAW264.7细胞内菌落数（80-90CFU/平皿）明显低于空质粒转染和正常RAW264.7细胞组（130-140CFU/平皿）；与对照组相比，实验组中目的抗菌蛋白对伤寒杆菌的抑杀率达37%。上述 结果证实：在RAW264.7细胞内表达的
32、muBPI36-259目的蛋白对胞内寄生的G-伤寒杆菌具有杀伤作 用，与国外文献报道结果相一致6。本实验首次制备了pcDNA3.1(+)-muBPI36-259 重组质粒，在RAW264.7细胞中成功表达了小鼠 BPI36-259目的蛋白；建立了体外胞内杀菌实验模型，证实小鼠BPI36-259目的蛋白对胞内寄生菌（伤 寒杆菌）具有抑杀作用。上述实验结果为小鼠功能性BPI36-259-Fc1融合蛋白的研究及其在体内外 抗感染作用的研究奠定了基础。参考文献1Calafat J, Janssen H, Tool A, et al. The bactericidal/permeability-incr
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38、e fragment of murine BPIgene and studies on its intracellular bacteriocide functionLi Li, Feng Ying, Lv Zhe, Kong Qingli, Liu Zhenlong, Zhao Dong, Gao Yan, Wang Wei*, An Yunqing*Department of Immunology, Capital Medical University, Beijing (100069)AbstractObjective: Clone the N-terminal fragment of
39、mouse BPI from 36 to 259 amino acid, get the target protein with bacteriocide function by transfected to RAW264.7 cells. Methods: We synthesized PUC57-muBPI1-281 plasmid by comparision to human BPI N-terminal functional fragment, then got mouse BPI36-259 functional fragment by PCR, this fragment was
40、 cloned in expression vector pcDNA3.1 (+) to construct pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 recombinant plasmid; by transfected to RAW264.7 cells using electroporation method, target protein expression was detected by Western-blot method. Furthermore, bacteriocide function to intracellular Salmonella typhi was
41、found on this recombinant protein. Results: The target protein of muBPI36-259 expressedin RAW264.7 cells successfully, and it could kill intracellular bacteriocideG- Salmonella typhi. Conclusion:We has successfully cloned mouse BPI36-259 gene fragment, transfected into RAW264.7cells and got the target antibacterial protein of muBPI36-259.Keywords: bactericidal/permeability-increasing protein; RAW264.7cell; Salmonella typhi作者简介：李丽（1982年-），女，硕士研究生；安云庆（1946年-），男，教授，博士生导师，主要从事抗感染免疫研究； 王炜（1973年-），女，讲师，博士，主要从事抗感染免疫研究。
