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1、精品论文大白菜染色体片段替换系的构建汪文科，王哲，韩新丽，李康宁，朴钟云（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）5摘要：芸薹种结球白菜亚种大白菜Chiifu是多国芸薹属 AA 基因组测序计划的模式植物。 本研究以自交系Chiifu为供体亲本,构建了基于芸薹种白菜亚种四九菜心自交系为遗传背 景的一套大白菜染色体替换系。利用分布于芸薹种基因组的 127 个 UGMS 和 SSR 标记，通 过对 4 代回交群体和 1 次自交群体的前景和背景选择，筛选出覆盖大白菜染色体 96.04%的64 份替换系。该替换系包括 15 份单片段、16 份双片段和 32 份 3 个片段以上的替换系材料。10这套染色
2、体替换系的创建为菜心育种、芸薹种作物重要性状的 QTL 定位以及基因功能分析 提供了新的种质资源。关键词：大白菜；四九菜心；染色体片段替换系；分子标记辅助选择中图分类号：S63415Construction of chromosome segments substitution lines(CSSL) of Chinese cabbge(Brassica rapa)WANG Wenke, WANG Zhe, HAN Xinli, LI Kangning, PIAO Zhongyun(College of Horticulture,Shenyang Agricultural University
3、, ShenYang 110866)Abstract: Chinese cabbage inbred line Chiifu (Brassica rapa ssp. pekinensis) is the Multinational20Brassica Genome Project model plant. In this study, Chiifu was used as donor parent to construct a set of chromosome segment substitution lines (CSSLs) in the background of flowering
4、Chinese cabbage inbred line Sijiu Caixin (Brassica rapa ssp. chinensis). During the process of 4 generation backcrossing and 1 selfing, 127 UGMS and SSR markers distributed on the B. rapa genome were employed for forground and background selection. As the results, 64 CSSLs25including 15 single-fragm
5、ent substitution lines, 16 double-fragments substitution, and 32 more than triple-fragments substitution lines were obtained. This CSSLs of Chinese cabbage will provide a new gerplasm for breeding materials of flowering Chinese cabbage and fine mapping ofquantitative trait loci of the B. rapa crops,
6、 as well as functional studies of genes in B. rapa.Keywords: Chinese cabbage; flowering Chinese cabbage; Chromosome Segment Substitution30Lines; Maker Assisted Selection0引言芸薹属（Brassica）作物不仅是油料、蔬菜、饲料和调味品的重要来源，而且富含膳食 纤维、维生素 C 和抗癌等多种有益营养成分。芸薹种(B. rapa)包括有结球白菜,白菜和芜菁35等 3 个亚种。它不仅具有丰富的遗传变异类型，同时也是研究芸薹属植物遗传
7、和进化的理 想材料。而作物的 多数经济性状属于数量性状，因此准确鉴定和定位数量性状位点（Quantitative Trait Loci，QTL），是进行 QTL 遗传效应分析、杂种优势利用研究以及分子 克隆的基础。染色体片段替换系（Chromosome Segment Substitution Lines，CSSLs），是通过分子标40记辅助选择（Maker Assisted Selection，MAS）技术和回交方法相结合，选择培育出的替换 有供体亲本不同染色体片段的系列群体。它的最大特点是不同的 CSSL 之间除了替换的供体 亲本染色体片段之外，具有与轮回亲本相似的遗传背景，即在轮回亲本的
8、遗传背景中只含有 一个或少数几个来自供体亲本的染色体片断。因此，CSSLs 的构建不仅为全面定位重要的基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20092013110006） 作者简介：汪文科，男，硕士研究生，主要研究方向：设施蔬菜分子生物学。 通信联系人：朴钟云，（1966-），男，教授，主要研究方向：蔬菜分子生物学。E-mail: zypiao- 8 -农艺数量性状位点和品种改良奠定基础，在遗传理论研究方面也具有重要意义。目前，油菜451、番茄2、水稻3、大麦4、小麦5、玉米6、棉花7、黄瓜8等作物均以构建了 CSSLs，并 广泛应用于主效 QTL，甚至微效 QTL 的定位。但尚未见
9、构建大白菜 CSSLs 的报道。分子标记的开发和遗传图谱的构建是创建 CSSLs 的前提。近年来，芸薹种的 SSR 标记得 到了大量的开发，并构建了多张遗传图谱9-15。王哲等16以四九菜心与大白菜自交系Chiifu的回交一代为作图群体，构建了包含有 10 条连锁群的芸薹种遗传图谱。该图谱总50长度为 1160 cM，共计有 120 个单一基因微卫星（Unigene-derived Microsatellite, UGMS） 和 131 个 SSR 标记。本研究在此基础上，结合 MAS 创建了一套以四九菜心为遗传背景， 替换有大白菜自交系Chiifu的 CSSLs。Chiifu基因组序列现已公
10、布17。研究结果将 为芸薹种重要农艺性状功的 QTL 精细定位、克隆和功能基因分析提供珍贵的植物材料。1材料与方法551.1 植物材料以大白菜自交系Chiifu为供体亲本，四九菜心自交系为轮回亲本用于构建大白菜 CSSLs。Chiifu为结球白菜亚种，叶片具毛刺，外叶绿色，内叶淡黄色，耐抽薹。 四 九菜心属白菜亚种，不结球，叶片光滑有蜡质，深绿色，极易抽薹，抗热耐湿能力强。以 上植物材料均由沈阳农业大学蔬菜分子生物学课题组提供。601.2 标记来源及遗传图谱的构建王哲等16利用 1085 对公共 SSR 引物9-15，筛选出 304 对多态性引物，并将其中的 251个标记定位到芸薹种遗传图谱。
11、通过该图谱 UGMS 和 SSR 标记序列与大白菜基因组序列（http:/brassicadb.org/brad/）的 BLASTN 比对，筛选出均匀分布于大白菜染色体、且 条带清晰和多态性明显的标记，用于分子标记辅助选择。根据各标记在大白菜染色体组中的65物理位置，利用 mapchart 软件构图。1.3 CSSLs 构建的过程CSSLs 的构建技术路线见图 1。以四九菜心为轮回亲本，Chiifu为供体亲本杂交 获得 F1，连续回交 4 次和自交 1 次。授粉过程在阳农业大学蔬菜基地日光温室进行。利用 SSR 标记鉴定各世代个体的基因型，并利用 CSSL Finder 软件对后代植株进行分析
12、，从中筛70选出覆盖大白菜染色体组的个体用于回交。具体过程如下：2010 年秋从 130 株 BC1F1 个体中 挑选出 16 株用于回交；2011 年春从 16 株回交后代 320 株 BC2F1 中，挑选出 46 株用于回交；2011 年秋从 46 株回交后代 460 株 BC3F1，挑选出 87 株用于回交；2012 年春从 87 株回交后 代 800株 BC4F1，挑选出 66 株 BC4F1 用于自交；2012 年秋鉴定由 660 株 BC4F1 自交得到 BC4F2 的基因型，挑选出了 64 株 BC4F1 用于构建染色体片段替换系。利用 GGT 软件绘制出每个替换75株系的替换片
13、段在染色体组上的具体分布图。图 1 大白菜染色体片段替换系的创建技术路线Fig.1 Process for CSSL construction of B. rapa801.4 UGMS 和 SSR 标记辅助选择1.4.1总 DNA 提取采集2 个亲本Chiifu、四九菜心和各世代个体的幼嫩叶片，利用改良 CTAB 法提 取总 DNA。紫外分光光度计检测 DNA 浓度，20保存备用。1.4.2PCR 反应及后代个体基因型鉴定85利用 127 个覆盖大白菜基因组的 SSR 标记鉴定各世代个体基因型。PCR 扩增采用 Ge等方法14-15。SSR 引物由南京金斯瑞生物公司合成。PCR 产物用 6%的
14、聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性分离，银染显色。银染参照 Ge 等14-15方法。 后代个体基因型与四九菜心相同的记为“A”，与Chiifu相同的记为“B”，杂90合基因型记为“H”，带型不清或缺失的记为“”。1.4.3后代植株选择1 1首先根据 BC F 代 130 个个体在 127 个 SSR 标记位点的基因型16，确定覆盖Chiffu全95100基因组的染色体目标替换片段的标记，作为前景分析标记，其余的作为回交世代背景选择的 标记使用。后代植株的选择结合基于 MAS 的基因组前景选择和背景选择进行，并利用 CSSL Finder 软件（0.9a14）（http:/mapdisto.free.
15、fr/CSSLFinder/）筛选植株用于回交或自交。后代 植株入选标准为入选的单株含有供体亲本染色体片段尽可能少，并尽可能覆盖整个供体亲本 基因组。CSSL Finder 是基于 Excel VBA 开发的一款软件，用于辅助选择轮回亲本基因组恢复率 最高，并能够覆盖供体亲本基因组的一套染色体片段替换株系。方法如下：将 Excel 数据转 化为 CSSL-finder 要求格式后，导入 CSSL-Finder 后进行供体亲本导入片段和所占基因组比 例分析。1.5 大白菜 CSSLs 的结构分析针对创建的大白菜 CSSLs，分析了替换片段长度、基因组含量、供体亲本基因组含量。 染色体替换片段的长
16、度依照 Young 等18和 Paterson 等19的“图示基因型法”计算 (图 2)。105110115120125130图 2 染色体替换片段长度计算示意图Fig. 2 Determination of the length of substituted segment in CSSL图示中 LMAX 代表替换片段的最大长度，LMIN 代表替换片段的最小长度，L 代表估计的 替换片段长度。在不考虑相邻两侧标记的双交换时，当染色体某一区段两侧的标记类型均为 供体基因型时(DD)时，则认为该片段完全被供体亲本所替换；反之，均为受体基因型时(RR)， 则完全恢复为轮回亲本片段；当相邻两侧标记为
17、不同基因型时，一个标记基因型为 D，另一 个标记基因型为 R 时，则认为该片段的 1/2 为源于供体亲本的替换片段长度，即 L=(LMAX+LMIN)/2。根据 L 值分别计算 CSSLs 系列的总替换片段长度、目标替换片段长度和染色体覆盖率。计算方法如下：总替换片段长度为插入有Chiifu染色体片段、即替换片段长度（L）的 总和；目标替换片段长度=总替换片段长度-（供体亲本残留片段长度+缺失片段长度）；染 色体覆盖率=（目标替换片段长度-缺失片段长度）/染色体长度100%，式中染色体长度为通 过大白菜基因组测序而得到的染色体碱基数17。总替换片段数为每条染色体中替换片段的 总数。供体亲本基因
18、组(donor parent genome, DPG)含量（%）= 源于供体亲本 SSR 标记位点 纯合数/SSR 标记总数100%。2结果与分析2.1 UGMS 和 SSR 标记的选择根据图谱中 UGMS 和 SSR 标记与大白菜基因组序列（http:/brassicadb.org/brad/） 的 BLASTN 比对结果，筛选出分布比较均匀、多态性明显和条带清晰的标记 127 个，用于 分子标记辅助选择。这些标记在芸薹种基因组中的分布见表 1 和图 3。表 1 染色体总长度、标记数、平均距离和最大距离染色体Chromosome标记数Number of markers平均距离(Mb)Aver
19、age distance标记间最大距距离(Mb)Maximum distance between nearmarkerA01142.0412.95A02151.865.02A03191.673.69A0463.167.36A05131.846.74A06102.634.97A07112.054.79A08121.804.89A09182.068.18A1091.964.07合计1272.026.23（平均） Table 1 The chromosome total length,number of marker,average distance,maximum distance图 3 所选标记
20、在大白菜染色体组上的分布Fig. 3 Distribution of markers used for selection in the Chinese cabbage genome1351402.2 替换片段在染色体上的分布经过 4 代回交和 1 代自交，通过 MAS 筛选出 64 份替换系（图 5）。该套替换系中各替 换系的供体亲本平均基因组含量为 3.91%，轮回亲本平均基因组含量为 96.10%。本套替换 系共插入有Chiffu染色体片段 190 个（表 2）。其中，插入有覆盖Chiffu染色体组的目标 片段有 64 个，总长度为 269.61 Mb。与已公布的大白菜基因组序列17相比
21、，目标片段的染 色体覆盖率为 96.04%。插入有Chiffu染色体单片段的替换系有 15 份，双片段的有 16 份， 三个及三个以上片段的有 33 份。替换系在每条染色体上的替换片段数、大小和覆盖率见表2。表 2 染色体替换系的片段数、大小和覆盖率Table 2 The number, size and coverage of CSSLs染色体染色体总长度总替换片段数总替换片段长度目标替换片段染色体覆盖率Chromosome(Mb) aNumber of(Mb) 覆盖长度(Mb) (%) substitution Total substitutionTarget substitutionPe
22、rcentage of segmentssegments lengthsegments lengthcoverageTotal length of chromosome145A01 28.61A02 27.85A03 31.72A04 18.97A05 23.94A06 26.27A07 22.59A08 21.60A09 37.12A10 17.60合计 256.271950.721745.133486.641060.401743.252078.391351.571261.773199.941743.29190621.10a 总长度为大白菜各染色体的测序碱基数1730.13 100.0025
23、.18 81.2339.71 100.0018.97 100.0025.20 94.5430.67 100.0025.57 100.0019.83 91.8235.89 92.7718.46 100.00269.61 96.04（平均）150Chiffu系 10 条染色体插入到四九菜心的片段数目和长度不等。平均每条染色体插入有 19 个片段，A03 染色体插入的最多为 34 个，A08 插入最少为 12 个。覆盖染色体组 的目标片段替换长度在 1.00 Mb18.35 Mb 之间，最长和最短的片段均位于 A07，最长片段 为 18.35Mb（40 号株系），最短片段为 1Mb（43 号株系）。
24、替换片段在 A01、A03、A04、A06、 A07 和 A10 的覆盖率为 100%。A02、A05、A08 和 A09 的覆盖率分别为 81.23%、94.54%、91.82%和 92.77%。155160图 5 64 份替换株系的替换片段在基因组上具体位置注：灰色（A）为轮回亲本基因型，浅蓝色（H）为杂合基因型，蓝色（B）为供体亲本基因型， 黄色（-）为未知基因型Fig.5 Genomic positions of the 64 substitution segment linesNote：Grey (A) represents the recurrent parent genotype
25、. Light blue (H) represents heterozygous genotype.Blue (B) represents donor parent genotype. Yellow (-) represents missing genotype.1651703讨论我们将芸薹种大白菜亚种结球白菜变种的染色体片段，通过 MAS 导入到同种植物白菜 亚种菜心变种的遗传背景中，获得了由 64 个株系构成的 CSSLs。该 CSSLs 不仅丰富了菜心 变种的遗传资源，也为今后芸薹种重要农艺性状的 QTL 定位提供了珍贵材料。CSSL 作为 一个永久群体，可以在相似的遗传背景下进行 QT
26、L 分析，从而消除遗传背景的干扰和 QTL 之间的互作，达到提高 QTL 分析的灵敏度和准确性20。如果在回交过程中不进行人工选择，DPG 含量在回交 4 代的理论值为 6.25%。本研究 所获得的 CSSLs 中 DPG 含量为 0.79%11.81%，平均为 3.91%，显著低于理论值。这是由 于在各回交世代进行的基于 MAS 的基因组前景和背景选择而导致的。因此，基于 MAS 的 选择可以显著提高构建 CSSL 的效率，并加快轮回亲本背景的恢复21。但由于该替换系只进精品论文175180185行了一次自交，部分替换系的供体亲本基因型尚未纯合。小孢子培养技术将加快纯合的进程。如汪骞等22在
27、构建大白菜导入系（Backcross introgression Lines , BILs）过程中采用了小孢子 培养技术，缩短了构建 BIL 的时间。但该大白菜 BIL 由于应用 BC2F1 群体，其遗传背景比较 复杂。染色体替换系的构建，常见有染色体片段缺失、替换片段过大和非目标替换片段的残留 等现象。如本研究创建的替换系，在 A02、A05、A08 和 A09 等 4 条染色体上存在缺失片段。 这些缺失片段，可以通过返回上一代群体中选出含有该缺失片段的株系来补足2,23；在 A01、 A04、A07、A08 染色体上存在超过 10 Mb 的替换片段，可能会造成未知片段的缺失。需要 通过标记
28、加密对这些片段进行验证，并将其进一步划分为小的替换片段；部分替换系中存在 非目标替换片段，即供体亲本的残留片段。残留片段是构建 CSSLs 过程中普遍存在的24-25。 这些残留片段将降低 QTL 定位的准确性和可靠性。因此，还需通过进一步的回交或自交， 淘汰残留片段获得含有单片段的纯合替换系。本套替换系的构建为芸薹种重要农艺性状的 QTL 精细定位、遗传育种以及功能基因的 研究奠定了良好的基础。参考文献 (References)1901952002052102152202251 Howell P M, Marshall D F, Lydiate D G. Towards developing
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