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1、精品论文牙鲆 CYP19A 基因启动子 CpG 富集区突变对繁殖内分泌的影响何峰，马瑞芹，丁玉霞，温海深，李吉方5（中国海洋大学水产学院，山东 青岛 266003）摘要：P450 芳香化酶是催化雄激素转化为雌激素的关键酶和限速酶。利用 PCR-SSCP 技术 检测牙鲆 CYP19A 基因启动子 CpG 富集区单核苷酸多态性（SNPs），并分析了突变位点对 牙鲆繁殖内分泌的影响。结果在 2 个 CpG 富集区（P1、P2 和 P3）发现 31 个 SNPs。经过多 重比较分析发现，P1 位点与雌鱼血浆雌二醇（E2）水平和雄鱼性腺指数（GSI）存在显著性10关系(p0.05)；P2 位点与雄鱼血浆
2、睾酮（T）水平和肝重指数（HSI）呈显著性相关(p0.05)。 这 2 个突变区域都与牙鲆的繁殖性能存在显著性相关。通过此研究为牙鲆的分子育种和繁殖 调控提供一些有价值的参考信息。关键词：牙鲆；CYP19A 基因；SNP；繁殖内分泌中图分类号：S91715Polymorphism in the CpG rich region of the CYP19A gene promoter affecting the reproductive endocrine of Japanese flounderHe Feng, Ma Ruiqin, Ding Yuxia, Wen Haishen, Li Jif
3、ang20(Fisheries College, Ocean University of China, 5 Yushan Road, ShanDong QingDao 266003) Abstract: Cytochrome P450arom is a key component of the enzymatic aromatase complex converting androgens to estrogens. The protein that catalyzes the aromatization of steroid hormones is encoded by the CYP19
4、gene. The aims are to detect polymorphism in the CpG rich region of the CYP19A gene promoter and analysis its effect on reproductive endocrine of25Japanese flounder. Three blocks (P1 and P2) including 31 SNPs were identified in the promoter region of CYP19A gene of Japanese flounder. Multiple compar
5、isons revealed that P1 wasassociated with serum E2 level in female individuals and GSI in male individuals (p0.05). And P2 had significantly associations with serum testosterone (T) level and HSI in male individuals (p0.05). All the three blocks had significantly association with the reproductive en
6、docrine of30Japanese flounder. The results would provide some valuable information for the marker assistedbreeding and reproductive regulation of Japanese flounder.Keywords: Japanese flounder; CYP19A gene; Polymorphism; Reproductive endocrine0引言35P450 芳香化酶（CYP19）是细胞色素 P450 家族中重要的一员，它是催化雄激素转化为 雌激素的末端
7、酶。在鱼类的性腺发育、卵巢滤泡发育、性别分化、维持第二性征等繁殖内分 泌活动中发挥着非常重要的作用1-4。众所周知，基因调控区可以调控基因的表达，如果调 控区序列发生突变，则可能会对基因的表达产生影响。CYP17 基因启动子区的突变 T-34C 正好位于 Msp AI 酶切位点，研究表明该突变与高加索男性的骨大小有关，但在其他人种内40未发现类似报道5,6。牛 TG 基因启动子区的突变 G82A 与牛的宰前活体质量和眼肌面积显著 相关（p0.05）7。Galay-Burgos 8等（2006）克隆了狼鲈 CYP19A 基因调控区，通过 cDNA 序列比对发现存在 3 个 SNPs。牙鲆 CYP
8、19A 基因编码区存在 2 个 SNPs 位点，其中 T993G 位点与牙鲆血浆雌二醇（E2）基金项目：高等学校博士学科点专项新教师基金（20090132120006）资助作者简介：何峰，（1974-），男，硕士研究生导师，鱼类繁殖生理与表观遗传学。E-mail: hefengouc- 7 -含量和性腺指数（GSI）存在显著性关系（p0.05）9。牙鲆 CYP19A 基因部分启动子区序45列（-720bp-30bp）（Genebank NO.AB303853）的 SNP 检测已经报道10。对新克隆获得的 牙鲆 CYP19A 基因启动子区序列（-2242bp-721bp）（Genebank NO
9、. AB304921）的 SNP 分 析未见报道，本研究以人工养殖牙鲆为实验鱼，检测了雌雄鱼 CYP19A 基因新克隆获得的启 动子区的 SNP，并分析了多态位点对牙鲆繁殖内分泌的影响。1材料和方法501.1实验动物此实验用牙鲆采自山东科合海洋高技术有限公司。在其工厂化养殖池塘内放养牙鲆 300 尾（20.383.71g），控制水流、充氧量、温度、光照、投饵量（4 mg/LO2、200.5、光 照时间 14L：10D）。饲养六个月后选取 150 尾牙鲆（242.1730.76g）运回实验室，在相似 的饲养条件下暂养一周后采集样品腺取出后，一部分组织迅速用 Bouin 氏液固定用于组织学55研究
10、，另一部分存放在-80用于基因组 DNA 的提取。1.2繁殖性能测定1.2.1放射免疫测定(RIA)方法测定血浆性激素含量 根据温海深（2008）11等激素测定方法，采用 I125 标记的放射免疫分析法测定(RIA)方法测定雌鱼血浆中睾酮（T）和雌二醇（E2）含量。601.2.2性腺指数和肝重指数 生物学指标包括体长，体质量，性腺质量，去内脏质量。计算性计算性腺成熟系数（GSI）=GW/( BW-VW）100，肝重指数（HSI）=LW/BW100。（BL：体长； LW：肝质量；BW：体质量；LW：肝重量；GW：性腺质量；BW-VW：去内脏质量；GSI：性腺指数；HIS：肝脏指数）。651.3主
11、要试剂所有试剂有 RNAiso Reagent ( TaKaRa 公司)、RNA 酶抑制剂(TaKaRa 公司)、M-MLV 逆转录酶(Promega 公司)、Taq 酶(TaKaRa 公司)、dNTPs 和 PCR 产物回收试剂盒等从北京天 根公司购买，克隆子测序由华大基因公司完成。1.4CYP19A 基因的引物设计70根据牙鲆 CYP19A 基因启动子区序列（-2242bp-721bp）（Genebank No. AB304921）， 利用 Oligo 6.0 软件设计引物，共设计六对引物，由上海生工生物工程有限公司合成（如表 1）。表 1 CYP19A 基因启动子区引物序列Table 1
12、 Primer sequences and information of Japanese flounder CYP19A promoter region引物引物序列长度退火温度PrimerSequencesLength(bp)Tm()Primer1TCGAGGCCAAGGACAGAAAGAT CTGGGAATTTCCTGAGCAGCATPrimer2AAGACGCTTGTGGAATGTTCCCTGCCTGGAGAACGATGCCCTATPrimer3GGTTCTCTGCGCTATCATGCAG ATGCTCTCTGGCTTAGGTCCTGPrimer4AGAGAGAGCAAATGGAACAA
13、AG GTTTCTACTGTGGAACTTGTGTPrimer5ACACAAGTTCCACAGTAGAAAC TACTACTGTTGCTGAGCTCTTT2916031060150593806029359752结果2.1PCR 扩增和 PCR-SSCP 结果将引物 1 的 PCR 扩增产物进行 SSCP 电泳，经检测发现引物 1 的 PCR 扩增片段共存在 三种基因型，根据后续的测序实验将这三种基因型分别定义为 P1-1、P1-2、P1-3。1、2、3、5、8、11 为 P1-1 基因型，6、10、12 为 P1-2 基因型，4、7、9、13 为 P1-3 基因型。SSCP80检测结果及三种基
14、因型的定义如图 1 所示。图 1 引物 1 的 SSCP 图及分型Fig .1The SSCP result of primer1 of the CYP19A gene promoter sequence85从引物 4 的 SSCP 电泳结果中可以看出，引物 5 的 PCR 扩增产物也存在三种基因型， 分别定义为 P2-1、P2-2、P2-3。1、3、7、10 为 P2-1 基因型，2、4、5、9 为 P2-2 基因型，6、8 为基因型。如图 2 所示为引物 4 的 SSCP 的检测结果及三种基因型的定义。图 2 引物 4 的 SSCP 图及分型90Fig 2 The SSCP result
15、of primer4 of the CYP19A gene promoter sequence2.2不同引物的各基因型的序列分析结果将 SSCP 图中呈现多态性的个体重新进行 PCR 扩增，然后将扩增产物经过胶回收、连 接、转化后，选择阳性克隆送至北京华大基因公司测序。测序结果进一步证实了多态位点的95存在。经过测序发现，牙鲆 CYP19A 基因启动子区的引物 1 共有四个连锁突变位点，分别为A-2200G 、C-2180T 、A-2126G、A-1997G。突变位点的位置及突变类型如表 2 所示。100位点 基因型表 2 引物 1 的测序结果Table 2 The sequencing re
16、sult of Primer 1-2200bp-2180bp-2126bp-1997bpP1-1GCA A P1-2ATGG P1-3ACG A105从表 3 中可以看出，CYP19A 基因启动子区第 4 对引物共存在 27 个连锁突变位点，分别 为 突 变A-1257T 、 AAAAAT-1252-1245插 入 或 缺 失 、 A-1216G 、 AATGAAATTTA-1213-1203 插入或缺失、T-1202C、TAA-1093-1091C、A-1014G、T-1001C、 C-987T、A-980C。表 3 引物 4 的测序结果Table 3 The sequencing resu
17、lt of Primer 4基因型 位点P2-1 P2-2 P2-3-1257bp-1252-1245bp-1216bp-1213-1203bp-1202bp-1093-1091bp-1014bp-1001bpAAAAAAT A A TAA ATAAAAAAT A C TAA ACT T AATGAAATTTA AC G T-987bp-980bpCACATC1101152.3不同 SNPs 与牙鲆繁殖性状的关联分析在本研究中检测到牙鲆 CYP19A 基因启动子区存在三个突变区域，共 31 个 SNPs。将这2 个突变区域与牙鲆的四个繁殖性状进行关联分析，结果如表 4 所示。结果表明：雌性牙鲆
18、， P1 位点对血浆雌二醇（E2）水平的效应均达到了显著水平（p0.05），其中 P1 位点达到了 极显著水平（p0.01）。 P2 位点则对性腺指数（GSI）的效应达到显著水平（p0.05）。雄 性牙鲆，P1 位点对性腺指数（GSI）达到了显著水平（p0.05）。P2 位点对于血浆睾酮（T） 含量和肝重指数（HSI）均达到显著水平（p0.05）。表 4 CYP19A 基因启动子区 SNPs 与牙鲆繁殖性状的关联分析Table 4 Associations between each of SNPs of Japanese flounder and reproductive traitsP1 位
19、点 P2 位点F ValueP ValueF ValueP ValueT (ng dL1)0.200.81742.330.1068E2(pg mL1)6.140.0038*1.400.2550FemaleHSI (%)0.870.42481.710.1892T(ng dL1)0.140.87313.410.0426*E2(pg mL1)1.790.18052.240.1190MaleHSI(%)0.470.62743.690.0335* GSI (%) 1.97 0.1492 21.83 .0001* GSI(%) 3.98 0.0264* 1.00 0.3757 注： *p0.05, * p
20、0.01120125130利用多重比较分析不同突变区域的不同基因型对牙鲆繁殖性状的影响，结果如表 5 所示。从表中可以看出，在雌鱼牙鲆，P1 位点， P1-3 基因型个体的血浆雌二醇（E2）含量仅 为 4.196 pg mL1，显著低于其他两种基因型；P2 位点，P2-3 基因型个体的性腺指数（GSI） 显著高于 P2-1 和 P2-2 基因型。在雄性牙鲆，P1 位点对于性腺指数（GSI），P1-2 基因型个 体的性腺指数（GSI）显著高于基因型 P1-3；P2 位点，对于血浆睾酮（T）水平和肝重指数（HSI），P2-1 基因型个体的水平最高。表 5 CYP19A 基因启动子区不同基因型与繁殖
21、性状的关联分析Table 5 Multiple comparisons of reproductive traits among different genotypes of Japanese flounder CYP19A gene promoter region位点Locus生理指标Physiological index1 基因型1 genotype2 基因型2 genotype3 基因型3 genotypeFemaleMaleP1P2P1P2E2 (pg mL1) GSI (%) GSI (%)T (ng dL1)9.8640.948a0.1390.069b0.3570.051ab18.
22、7502.959a8.2700.989a0.2150.050b0.4580.081a11.1642.646ab4.1961.315b0.5960.047a0.1680.071b8.8832.486bHSI (%)1.3610.098a1.0720.087b1.0300.082b135注：a, b 同一行中数据标有不同差异显著（p0.05）a, b Different superscript letters of mean within a row mean significant difference at p0.051402.4CYP19A 基因启动子区潜在调控元件及转录因子结合位点的预测利
23、用网站网站（http: /www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html ）的 TFSEARCH（version1.3） 软件分析预测了 CYP19A 基因 5启动子区的 31 个 SNPs 是否会引起潜在的调控元件 及转录因子结合位点的改变。预测结果发现存在以下转录因子的改变，P1 位点：HSF，CF2-II， Tst-1/ SRY，GATA-1（表 6）；P2 位点：BR-CZ，S8/ CdxA，BR-CZ，SRY（表 7）。这些 转录因子的改变可能会影响 CYP19A 基因的转录和翻译表达水平，进而影响雌激素的合成和 牙鲆繁殖内分泌轴。145表 6 P1位点的
24、转录因子 Table 6 Transcription factors of the P1 locus of CYP19A gene 基因型 -2200bp -2180bp -2126bp -1997bpP1-1 HSF CF2- Tst-1P1-2 SRY Tst-1P1-3 SRY GATA-1 表 7 P2位点的转录因子Table 7 Transcription factors of the P2 locus of CYP19A gene基因型-1213-1203bp-1014bp-1001bp-980bpP2-1P2-2P2-3 CdxABR-CZBR-CZ BR-CZNkx-2S8S8
25、SRY1501551603讨论在本研究中，我们发现在 CYP19A 基因的 5启动子区共存在 3 个突变区域，31 个 SNPs。 预测结果显示这些突变引起了 CYP19A 基因启动子区转录因子的改变，并且这 2 个位点与牙 鲆繁殖生理学指标呈显著性相关水平。转录因子是调控基因表达的调控元件，一旦发生改变 就会对基因的功能产生影响。有研究报道 CYP17 基因启动子区的突变 T-34C 正好位于 Msp AI 酶切位点，该突变与高加索男性的骨大小有关5。位于连接蛋白-40（Cx-40）基因启动子B 的 SNP 位点影响了 Cx-40 基因的转录和机体内 Cx-40 蛋白的表达，并且与心房颤动相
26、关， 但也有不同报道称该突变并未对机体产生影响12,13。位于人的 CYP19A 基因调控区内的突变 位点 Aro1（rs4775936）是一个功能性的突变位点，与骨质疏松呈紧密联系14。P1 位点位点 对血浆雌二醇（E2）水平的效应达到极显著（p0.01）水平，P2 位点对性腺指数（GSI）的 效应达到显著（p0.05）水平。因此我们推断突变引起的转录因子的改变可能对基因的表达 调控产生影响。由于群体规模较小，2 个位点的遗传效应还需要扩大样本量作进一步的验证。在本研究中预测的 CYP19 基因启动子区 GpC 岛区域内含有多个甲基化位点，P1 位点突 变引起了转录因子的改变。动植物体内存在
27、多种形式的转录调控机制来调控基因的转录表达，DNA 甲基化是对生物体内众多基因都有调控作用的机制之一。DNA 甲基化程度与基因165170175180185190195200205210215的表达呈负相关，启动子区较低的甲基化可以提高转录活性，如果甲基化水平增加那么基因的表达水平就会降低。日本青鳉 P450 芳香化酶基因家族调控区甲基化与鱼体抗病有关15。 牛 CYP19 基因的第三外显子有一个甲基化位点，该位点在表观调控下对牛 CYP19 基因的表 达存在影响16。在雌鱼中，P1-3 基因型个体的 E2 水平显著低于 P1-1、P1-2 基因型，在雄鱼 中 P1-3 基因型的性腺指数（GS
28、I）最低。但具体的调控机制还需进一步的实验验证。P2 位点，在-1213-1203bp 处增加了序列 AATGAAATTTA，增加了一个转录因子 CdxA。 P2 位点与雌鱼的性腺指数（GSI）和雄鱼血浆睾酮（T）含量和肝重指数（HSI）呈显著性 相关。转录因子 CdxA 能够使目的基因的转录水平显著提高。在鸡类胰岛生长因子-1（IGF-1） 中，5启动子区的突变 C/A 增加了转录因子 CdxA，IGF-1 基因的突变型个体的基因转录活 性、表达水平比正常个体的高17。在雌鱼中，P2-3 基因型个体的 GSI 显著高于 P2-1、P2-2 基因型，推断增加的转录因子 CdxA 提高了 CYP
29、19A 基因的转录活性。在鱼类中，血浆雌二 醇（E2）含量与性腺指数（GSI）相一致，但是在本研究中我们并未检测到 P2 位点三种基 因型的血浆雌二醇（E2）含量存在显著性差异。但此结果还需进一步的实验加以验证。4结论本研究采用 PCR-SSCP 法检测了牙鲆 CYP19A 基因的 5启动子区的 SNPs，并分析了突 变对牙鲆繁殖内分泌的影响。初步探讨了 CYP19A 基因 5启动子区的分子结构以及分子调 控机制，为牙鲆的分子育种和理解牙鲆繁殖调控机制提供了理论依据。参考文献 (References)1 HARADA N, HONDA S I, HATANO O. Aromatase inhi
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