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1、人类基因组DNA的提取,主讲人：协助者：,人类基因组DNA,人类基因组DNA提取的原理,哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞。,人类基因组DNA提取的原理,根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持
2、DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。,人类基因组DNA提取的原理,制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。,人类基因组DNA提取的原理,S
3、DS是一种去污剂，破坏细胞膜的脂质膜。,蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类）及脂类和胺类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA一同沉淀下来，干扰酶的活性，消化后需要用酚、氯仿抽提纯化。,酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在其中。（加入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细胞降解物而纯化DNA，可以避免酚的污染。）,人类基因组DNA提取的方法,从全血中提取,从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取,从胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞中提取（常用于产前诊断）,根据来源：,人类基因组DNA提取的方法,从全血中提取细胞裂解液：裂解细胞膜，收集细胞核SDS：破裂核膜蛋白酶K
4、：使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来苯酚氯仿：抽提去除蛋白质无水乙醇：沉淀DNA75%乙醇：洗涤DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE(Tris(三羟甲基氨基甲烷)+EDTA)中即得到高分量的DNA,人类基因组DNA提取的方法,从全血中提取裂解与RNase/蛋白酶K 消化1.取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。2.加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 l结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm
5、离心30秒。,人类基因组DNA提取的方法,从全血中提取裂解DNA与吸附柱结合3用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。,!注意!待转移上清约1300l，离心吸附柱容量约650 l，故需每次转移上清650 l到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。,人类基因组DNA提取的方法,从全血中提取裂解,DNA的纯化4.再加入600 l洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。5重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤
6、缓冲液。6小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 l洗脱缓冲液(elution buffer)到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。7取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。,人类基因组DNA提取的方法,从口腔上皮脱落细胞中提取裂解,与裂解液消化1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。2、沉淀中加1ml 1细胞核裂解液(STE)，打散细胞
7、团、混匀，再加酶解混合液（含350l STE、150l 10%SDS和10l 20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37温箱过夜或5034小时。,人类基因组DNA提取的方法,从口腔上皮脱落细胞中提取裂解,离心除杂质3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。5、重复步骤4一次。,人类基因组DNA提取的方法,从口腔上皮脱落细胞中提取裂解,DNA的纯化6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加
8、入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100l TE中。7、TE溶解的DNA，在4下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70保存。,人类基因组DNA提取的方法,酚、氯仿萃取法酶学法饱和盐析法,根据原理：,人类基因组DNA提取的方法,酚、氯仿萃取法苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出
9、来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。,人类基因组DNA提取的方法,饱和盐析法蛋白质在
10、低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。,人类基因组DNA提取的结果分析,聚合酶链式反应(PCR)紫外分光光度法琼脂糖凝胶电泳法限制性内切酶酶切法,人类基因组DNA提取的结果分析,聚合酶链
11、式反应(PCR)PCR是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。,人类基因组DNA提取的结果分析,聚合酶链式反应(PCR),人类基因组DNA提取的结果分析,紫外分光光度法 提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。组成DNA的碱基均具有
12、一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA或RNA为40g/ml；单链寡聚核苷酸为20g/ml,人类基因组DNA提取的结果分析,紫外分光光度法分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280
13、nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液。,人类基因组DNA提取的结果分析,限制性内切酶酶切法限制性内切酶(RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中
14、的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：、和型，型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。同一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。限制性核酸内切酶分析技术是病原变异、毒株鉴别、分型及了解基因结构和进行流行病学研究的有效方法，对动物检疫有很重要的实用意义，尤其对区别进出境动物及动物产品携带病毒是疫苗毒还是野毒，以及推论其是本地毒还是外来毒有很重要的意义。,人类基因组DNA提取的结果分析,琼脂糖凝胶电泳法 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种
15、多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。,人类基因组DNA提取的应用,1、人类基因组测序2、疾病基因的定位克隆3、多基因病的研究,人类基因组DNA提取的应用,1、人类基因组测序1990年1998年，人类基因组序列已完成和正在测序的共计约330Mb，占人基因组的11%左右；已识别出人类疾病相关的基因200个左右。
16、此外，细菌、古细菌、支原体和酵母等17种生物的全基因组的测序已经完成。1998年9月14日美国国家人类基因组计划研究所（NHGRI）和美国能源部基因组研究计划的负责人在一次咨询会议上宣布，美国政府资助的人类基因组计划将于2001年完成大部分蛋白质编码区的测序，约占基因组的三分之一，测序的差错率不超过万分之一。同时还要完成一幅“工作草图”，至少覆盖基因组的90%，差错率为百分之一。2003年完成基因组测序，差错率为万分之一。这一时间表显示，计划将比开始的目标提前两年完成。,人类基因组DNA提取的应用,2、疾病基因的定位克隆人类基因组计划的直接动因是要解决包括肿瘤在内的人类疾病的分子遗传学问题。6
17、000多个单基因遗传病和多种大面积危害人类健康的多基因遗传病的致病基因及相关基因，代表了对人类基因中结构和功能完整性至关重要的组成部分。所以，疾病基因的克隆在HGP中占据着核心位置，也是计划实施以来成果最显著的部分。在遗传和物理作图工作的带动下，疾病基因的定位、克隆和鉴定研究已形成了，从表位蛋白质基因的传统途径转向“反求遗传学”或“定位克隆法”的全新思路。随着人类基因图的完成，3000多个人类基因已被精确地定位于染色体的各个区域。今后，一旦某个疾病位点被定位，就可以从局部的基因图中遴选出相关基因进行分析。这种被称为“定位候选克隆”的策略，将大大提高发现疾病基因的效率。,人类基因组DNA提取的应用,3、多基因病的研究目前，人类疾病的基因组学研究已进入到多基因疾病这一难点。由于多基因疾病不遵循孟德尔遗传规律，难以从一般的家系遗传连锁分析取得突破。这方面的研究需要在人群和遗传标记的选择、数学模型的建立、统计方法的 改进等方面进行艰苦的努力。近来也有学者提出，用比较基因表达谱的方法来识别疾病状态下基因的激活或受抑。实际上，“癌肿基因组解剖学计划（Cancer Genome Anatomy Project,CGAP”就代表了在这方面的尝试。,人类基因组DNA提取的前景,1)基因转录表达谱及其调控的研究 2)蛋白质组学研究3)生物信息学的应用,Thanks,
