【精品论文】从马达蛋白层面探讨推拿对坐骨神经损伤.doc

《【精品论文】从马达蛋白层面探讨推拿对坐骨神经损伤.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【精品论文】从马达蛋白层面探讨推拿对坐骨神经损伤.doc（6页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、精品论文从马达蛋白层面探讨推拿对坐骨神经损伤大鼠轴浆运输功能的影响姚斌彬，文梅，梅旭晖，于天源5（北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029）摘要：目的：观察推拿对坐骨神经损伤大鼠脊髓中马达蛋白 kinesin 及 dynein 表达改变的影响，探讨推拿治疗坐骨神经损伤的起效机制。方法：建立大鼠坐骨神经夹持损伤模型，通过 腓肠肌湿重测量、热痛阈实验观察正常组、假手术组、模型组、模型对照组、推拿组大鼠的 病理学、行为学变化；通过免疫组织化学染色观察各组大鼠脊髓内 kinesin 及 dynein 表达情10况，并统计分析各组间的差异。结果：通过对模型组和模型对照组大鼠热痛阈、腓肠肌湿重的检测

2、，得出坐骨神经损伤后大鼠的感觉及运动功能明显降低的结果，在推拿治疗后，腓肠 肌湿重测量及热痛阈实验评分明显升高，并在治疗 20 天后与正常组无显著性差异；模型组、 对照组及推拿组 kinesin 及 dynein 免疫组化表达与正常组相比均有显著性提高，推拿组与模 型组、对照组相比也具有显著性差异。结论：推拿治疗可以通过提高 kinesin 及 dynein 在脊15髓中的表达，促进轴浆运输功能恢复，帮助周围神经修复，并最终改善坐骨神经损伤大鼠的 运动及感觉功能。关键词：推拿；坐骨神经损伤；轴浆运输；马达蛋白中图分类号：R244.120Investigation of TuinaTherapy

3、 on Axoplasmic Transport ofSciatic Nerve Injury Rats from Motor Protein LevelYAO Binbin, WEN Mei, MEI Xuhui, YU Tianyuan(School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing100029)25Abstract: Objective: To observe the effect of massage motor protein kinesin and

4、dynein expression changes in rat spinal cord on injury of sciatic nerve, action mechanism of massage in the treatment ofsciatic nerve injury. Methods: to establish the rat sciatic nerve injury model by clamping, gastrocnemius muscle wet weight measurement, thermal pain threshold observed in normal g

5、roup, sham operation group, model group, model group, pathological massage group rats, behavioral changes30were observed by immunohistochemical staining; spinal cord of rats and the expression of dynein in kinesin the situation, and statistical analysis of differences between the groups above. Resul

6、ts: through the detection of the model group and the model group rats heat pain threshold, gastrocnemius muscle wet weight, the sensory and motor function after sciatic nerve injury in rats significantly reduced theresults, in the massage treatment, wet weight of gastrocnemius muscle pain threshold

7、measurement and35thermal test score increased significantly, and there was no significant difference in treatment 20 days later and the normal group; model group, control group and massage group kinesin and dynein immunohistochemical expression compared with normal group were significantly improved,

8、 the massage group and the model group compared with the control group, there are significant differences. Conclusion: massage therapy can improve the expression by kinesin and dynein in the spinal cord,40promote the recovery of axon-plasma transporting function, help the repair of peripheral nerve,

9、 and ultimately improve the injured rat sciatic nerve motor and sensory function.Key words: Tuina;Sciatic Nerve Injury;Axoplasmic Transport;Motor Protein基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20100013110005） 作者简介：姚斌彬（1986-），男，博士研究生，推拿治疗周围神经损伤的功能评价及作用机理研究 通信联系人：于天源（1965-），男，教授，推拿治疗周围神经损伤的机理研究. E-mail: yutianyuan-

10、6 -0引言神经细胞内的轴浆运输具有顺向及逆向流动的特性，能够使得营养物质从胞体运输到轴45突远端，同时使轴突末端产生的营养物质运送至胞体1 。而轴浆运输的发生依赖于马达蛋 白中的驱动蛋白（kinesin）与动力蛋白（dynein）水解 ATP 所产生的能量2。其中 kinesin 为轴浆运输的顺向流动提供动力， dynein 则为逆向运动提供动力3,它们为神经元胞体及残 端轴突的再生提供了必要的营养保证。本课题组前期的研究发现，推拿对于治疗周围神经损 伤效果明显，本次研究主要观察在周围神经损伤后，通过推拿治疗，受损神经相应节段脊髓50中的 kinesin 及 dynein 是否能提高表达，以

11、促使轴浆运输功能的恢复、周围神经的再生，从 而探寻推拿治疗周围神经损伤的起效机制。1材料与方法1.1实验动物清洁级 SD 大鼠 80 只（北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK55（京）2012-0001），雄性（因雌激素能促进周围神经损伤修复）4，体重 18015g。购入后， 适应性饲养 1 周。1.2动物分组采用随机数字表将实验动物随机抽出 20 只为正常组，20 只作为假手术组，再将剩下 40只作为造模组。造模成功后，将造模组随机分为模型组 20 只、模型对照组 10 只、推拿组6010 只。1.3取材时间点于造模 7 天后、推拿治疗 10 次及 20 次后进行行为学

12、检测及免疫组化取材。1.4仪器及试剂仪器：按摩推拿手法模拟仪（中华人民共和国发明专利号 200710187403.1），RY-32 热65源自动测试仪、电热恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司 SKP-02.600）、病理石蜡包 埋机（沈阳市龙首电子仪器有限公司 LS-100）、石蜡切片机（北京弘泰嘉业科技发展有限公 司 Finesse 325）、显微镜（麦克奥迪 BA400）等。试剂：Kinesin 抗体（Kinesin 1 antibody） 生产厂家 biorbyt 编号 orb18770；Dynein 抗体（Anti-Dynein）生产厂家 Abcam 编号 ab6304。1.5模型

13、制备70运用夹持损伤法制作坐骨神经损伤大鼠模型：10水合氯醛以 0.35ml/100g 的剂量腹腔 注射麻醉；手术区常规消毒；于右侧臀股交界处沿坐骨神经走行方向剪开大约 1cm 的皮肤 切口，止血，用止血钳钝性分离肌肉层，暴露梨状肌下缘及坐骨神经；用 10 号持针钳，满 扣(经过测量压力为 5kg)夹持梨状肌下缘 5mm 处的坐骨神经 5s，造成 2mm 长的损伤点；术 后逐层消毒、缝合。假手术组暴露坐骨神经但不作夹持，其余步骤同模型组。751.6干预方法各组均在造模后第 7 天开始干预。推拿组使用手法模拟仪（按摩头为直径 2mm 的圆形 光滑接触面）依次刺激束缚后大鼠右侧殷门、承山、阳陵泉穴

14、；手法模拟为点法、拨法、揉80859095100法；刺激力量为 20N。每穴每法 1 分钟，总计 9 分钟。手法模拟仪按摩头为直径 2mm 的圆形光滑接触面；正常组、假手术组、模型组不作干预；模型对照组大鼠每天束缚 9 分钟。1.7实验检测分别于造模后 7d、推拿治疗 10 次、20 次后，进行行为学、病理学和免疫组化检测，指 标检测采用盲法检测。1.7.1光热耐痛阈测定 评价痛觉恢复情况，主要步骤为：测试前将大鼠置于热源测试仪检测盒内；待动物适应环境安静后，将辐射灯光源处放置在足跖部中后 1/3 处，同时按下开始按钮；待大鼠自动抬脚时计时自动停止，记录仪器上的时间，以此作为大鼠热痛缩腿反应潜

15、伏期（PWL）。 整个测试过程中保持安静，室温为 2025，设定切断时间为 21S 防止大鼠组织热灼伤。 每侧测定 3 次，取平均值。1.7.2腓肠肌湿重测量 评价肌肉恢复情况，主要步骤为：将大鼠麻醉后处死；暴露患侧腓肠肌；沿肌腱钝性分离腓肠肌；剪断肌腱，取得完整腓肠肌；运用电子天平进行称重，精确到 0.001g。1.7.3免疫组化染色大鼠灌注固定，取 L3L5 节段脊髓，入 4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，经脱 蜡、水化，抗原修复，SABC 法染色，脱水、透明、封片、镜检，观察蛋白表达，并用 Image-Pro Plus 6.0 图像软件进行平均光密度半定量统计。2结果2.1热痛阈实验

16、检测结果如表 1 所示，造模 7d 后，模型组与正常组相比热痛阈时间明显升高（p0.05）；治疗10 次后，推拿组与模型组及正常组均有显著性差异，但时间介于二者之间；治疗 20 次后， 推拿组与模型组相比明显降低（p0.05），与正常组相比无显著性差异（p0.05）。表 1 造模后 7 天、推拿治疗 10 次、20 次热痛阈实验结果（Xs，s）正常组假手术组模型组模型对照组推拿组造模 7d 后治疗 10 次5.680. 195.650.187.192.286.612.339.843.2011.733.239.492.64*8.821.98*治疗 20 次5. 711.155.772.2411.

17、723.0710.822.196.171.79*注：与正常组比较：表示 P0.05；与模型组比较：表示 P0.05；1052.2腓肠肌湿重检测结果如表 2 所示，造模 7d 后，模型组与正常组相比腓肠肌湿重明显降低（p0.05）；治疗10 次后，推拿组与模型组及正常组均有显著性差异，但重量介于二者之间；治疗 20 次后， 推拿组与模型组相比明显升高（p0.05），与正常组相比无显著性差异（p0.05）。110表 2 造模后 7 天、推拿治疗 10 次、20 次腓肠肌湿重测量（Xs，g）正常组假手术组模型组模型对照组推拿组造模 7d 后治疗 10 次1.040. 101.350.220.950.

18、011.330.290.650.060.770.050.670.031.180.04*治疗 20 次1. 760.181.740.330.860.040.990.031.710.03*注：与正常组比较：表示 P0.05；与模型组比较：表示 P0.05；2.3免疫组化结果1151202.3.1kinesin 表达经 Image-Pro Plus 6.0 进行平均光密度检测，如表 3 所示，模型组和模型对照组 kinesin 平均光密度与正常组相比明显升高（p0.05），推拿组与模型组相比明显升高（p0.05）， 与正常组相比明显升高（p0.05）。表达情况如图 1、2 所示。表 3 造模后 7

19、天、推拿治疗 10 次、20 次 kinesin 平均光密度（Xs）正常组假手术组模型组模型对照组推拿组造模 7d 后治疗 10 次0.240.0250.230.0210.230.0220.220.0160.310.0360.330.0500.350.0250.450.067*治疗 20 次0.230.0280.230.0270.320.0440.360.0470.420.020*注：与正常组比较：表示 P0.05；与模型组比较：表示 P0.05；图 1 治疗 10 次后 kinesin 免疫组化结果（400 倍，左：模型对照组、右：推拿组）125图 2 治疗 20 次后 kinesin 免疫

20、组化结果（400 倍，左：模型对照组、右：推拿组）1302.3.2dynein 表达经 Image-Pro Plus 6.0 进行平均光密度检测，如表 4 所示，模型组和模型对照组 dynein 平均光密度与正常组相比明显升高（p0.05），推拿组与模型组相比明显升高（p0.05）， 与正常组相比明显升高（p0.05）。表达情况如图 3、4 所示。表 3 造模后 7 天、推拿治疗 10 次、20 次 dynein 平均光密度（Xs）正常组 假手术组 模型组 模型对照组推拿组 造模 7d 后 0.350.021 0.360.030 0.440.037治疗 10 次 0.360.028 0.360

21、.032 0.420.035 0.430.0270.480.051*治疗 20 次 0.370.024 0.360.013 0.430.042 0.420.0380.470.034*注：与正常组比较：表示 P0.05；与模型组比较：表示 P0.05；135图 3 治疗 10 次后 dynein 免疫组化结果（400 倍，左：模型对照组、右：推拿组）1403讨论图 4 治疗 20 次后 dynein 免疫组化结果（400 倍，左：模型对照组、右：推拿组）145本次实验，在坐骨神经夹持损伤模型建立后，根据“穴位-神经-肌肉”原则，选取沿坐 骨神经干、胫神经、腓总神经分布的三穴殷门、承山、阳陵泉，针

22、对此三穴行推拿手法，以 刺激坐骨经支配的股二头肌、腓肠肌、胫前肌。治疗结束后，从热痛阈与腓肠肌湿重角度综 合评价推拿对大鼠坐骨神经损伤的恢复情况，明确了推拿可促进周围神经损伤的修复。周围神经损伤从实质上来说不仅仅是神经轴突的损伤，而是整个神经细胞的损伤5。神精品论文150155160165170经的轴浆运输功能如若不能恢复正常，则效应器失神经营养支配的时间延长，发生萎缩，功能恢复不佳，尤其是运动功能难以恢复。远端神经末梢所合成的物质亦不能作用于神经元胞 体，神经元失去营养调节，功能受损，甚至死亡6。因此，轴浆运输功能的恢复是神经修复 的保证，是评价修复效果的重要指标，是神经修复的最初证据。在神

23、经细胞中，轴浆运输是神经细胞的特性之一，而马达蛋白则是轴浆运输的动力来源, 包括驱动蛋白（kinesin）以及动力蛋白（dynein）。其中 kinesin 在轴浆运输流中充当顺向运 输的动力，将神经元胞体所产生的营养物质以及逆向运输的动力蛋白 dynein 运送至受损轴 突末端。dynein 到达轴突末端后，再直接或间接的与营养物质结合，将其运送至神经元胞 体。在这个过程中，营养物质就好比是货物，神经微管好比是公路，而 kinesin 和 dynein 就是行驶在公路上，运送货物的卡车。造模后，由于假手术组仅仅作了肌肉的剥离，将神经暴露，未作夹持，因此神经并未受 损，所以从造模 7d 后马达

24、蛋白的表达来看，正常组与假手术组都没有明显改变，而模型组 的表达则有所升高，表明机体在自我修复。在治疗 10 次及 20 次以后，推拿组大鼠脊髓内的 kinesin 及 dynein 表达均有显著性提高，与正常组有显著性差异，与模型组相比也有显著提 高。考虑到受治疗时间的限制，推测如果继续治疗，当受损神经恢复到一定程度，kinesin 及 dynein 的表达会逐渐降低，趋于正常。模型组亦是如此，但推拿组的轴浆运输功能会得 到改善。因而在最终比较时，虽然 kinesin 及 dynein 的表达无显著性差异，但是大鼠的行为 学会出现较大差异，即推拿组要明显优于模型组。这得益于通过推拿，提高了脊

25、髓中马达蛋 白的表达，促进了轴浆运输功能的恢复。4结论推拿治疗周围神经损伤时，可以通过提高马达蛋白 kinesin 及 dynein 在受损神经相应节 段脊髓内的表达，促进轴浆运输功能的恢复，使得营养物质能够在神经元胞体与受损轴突之 间的轴浆中进行双向运输，帮助受损周围神经的修复，并最终改善坐骨神经损伤大鼠的运动 及感觉功能。参考文献 (References)1751 吕传真等.骨骼肌疾病M.上海：上海科学技术出版社，1987:15-17.2 Caleo M.Different rates of horseradish peroxidase transport in the opticnerv

26、e of neonatal and adult ratsJ.Neurosci,1996,72(3):725-7303 Qian JJ,Cheng YB,Yang YP,etal.Differential effects of overexpression of wild-type and mutant humanalpha-synuclein on MPP+_induced neurotoxicity in PC12 cells.Neurosci Lett,2008,435(2):142-6.4 王迅，刘兴波，17雌二醇大鼠坐骨神经损伤的保护J.中国临床康复，2006，10（26）：335 顾立强，裴国献，主编.周围神经损伤基础与临床M.北京:人民军医出版社，2001，70 一 1006 许建民.腹腔内连续应用 NGF 对周围神经损伤后骤降运输恢复作用的实验研究D.长沙:中南大学，2009.180