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1、免疫比浊分析技术原理与进展,桂林英美特生物技术研究所,一、免疫学基本原理二、免疫沉淀三、免疫比浊技术原理,免疫比浊检验技术原理与进展,一、免疫学基本原理,1、抗原与抗体2、抗原抗体的结合免疫学反应3、免疫学反应的检测技术,1、抗原与抗体,抗原（Antigen,Ag）是刺激机体产生免疫应答的物质。“应”是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞“答”是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外）抗原的免疫原性和免疫反应性完全抗原与半抗原抗原表位与抗原结合价位,1、抗原与抗体,1、抗原与抗体,免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异
2、性抗体及免疫效应细胞）的性质。,Ag,抗体,免疫原性示意图,1、抗原与抗体,免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。,抗原性（免疫反应性）示意图,抗体,1、抗原与抗体,完全抗原（complete antigen)具有免疫原性和抗原性的物质。半抗原（hapten，又称不完全抗原 incomplete antigen）无免疫原性，只有抗原性的物质。载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。半抗原+蛋白质（载体）完全抗原。,半抗原,+,载体,抗体,完全抗原,半抗原载体效应示意图半抗原+蛋白质（载体）完全抗原,1、抗原与抗体,抗原决定簇：抗原分子存在
3、的能TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。构象决定簇：构象决定簇（conformational determinant）由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的氨基酸肽片段构成的决定簇。抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够与抗体分子结合的决定簇数目。,1、抗原与抗体,1、抗原与抗体,抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决定着抗原-抗体反应的高度特异性。,1、抗原与抗体,共同表
4、位（common epitope）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。交叉反应（cross-reaction）指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。,1、抗原与抗体,抗体（antibody,Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体,1、抗原与抗体,抗体的分子结构,1、抗原与抗
5、体,“Y”型，四肽链重链（5种:、）轻链（2种:、）可变区（V区）超变区（又称CDR 互补决定区）骨架区:FR恒定区（C区）铰链区,1、抗原与抗体,根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以分为5类：IgG(gamma)IgA(alpha)IgM(mu)IgD(delta)IgE(epsilon),1、抗原与抗体,根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分为2型)(kappa)型(lambda)型轻链存在于各类免疫球蛋白中同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型,1、抗原与抗体,抗体的生物学功能特异性结合抗原 超变区表位 静电力、氢键、范德华力 可逆 影响因素：PH、温度、电解质,结合基础,2、抗原抗体的结合免
6、疫学反应,抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。四种分子间引力（电荷引力、范登华引力、氢键结合力 和疏水作用）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。,2、抗原抗体的结合
7、免疫学反应,典型的抗原抗体结合反应,特异性识别,形成抗原抗体复合物,2、抗原抗体的结合免疫学反应,抗原抗体反应的特点,特异性按比例可逆性,2、抗原抗体的结合免疫学反应,2、抗原抗体的结合免疫学反应,影响抗原抗体反应的因素电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（1215mV）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀
8、物或凝集物。酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为68进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37。每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，
9、20以上反而解离。其它：适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。,3、免疫学检测技术,凝集与沉淀比浊电位、微天平,放射性核素标记酶标记、荧光标记和胶体金标记化学发光物标记或偶联化学发光反应,非标记免疫检测技术,标记免疫检测技术,二、免疫沉淀,凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应（agglutination）是最经典的免疫学检测技术。,二、免疫沉淀,免疫沉淀反应:(precipitation)可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合，出现的沉淀现象。,免疫沉淀,液体内沉淀反应,凝胶内沉淀反应,免疫电泳技术,免疫浊度技术,絮状沉
10、淀试验,环状沉淀试验,单向扩散试验,双向扩散试验,试管法平板法,免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫固定电泳,透射免疫比浊turbidimetermeasure 散射免疫比浊nephelomitermeasure,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀释,加入抗血清,各管抗体量不变,振摇 混匀、37孵育,沉淀量不同,试管内絮状沉淀试验,轻摇,絮,状,沉,示,意,图,淀,Ag,AbAg,Ab,Ag,凝胶内沉淀试管法,单向琼脂扩散试验,凝胶内沉淀试验平板法,标准品抗原浓度测定,不同病人抗原浓度测定,原理,将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由
11、扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。,凝胶内沉淀双向琼脂扩散原理示意图,Ab,Ag,模拟图,染色琼脂图,1.抗原抗体双向自由扩散2.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧,三、免疫比浊技术原理,当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。,检测器,光源 透镜 滤光片,平光线,散,射,透射光,光波,比浊测定法原理示意图,d,当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射，在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表复合物的量,当
12、复合物小于入射波长时呈全透射，透射与散射相当,三、免疫比浊技术原理,免疫比浊技术分类：,按光路,透射免疫比浊散射免疫比浊,按测定时间,终点比浊速率比浊,按增敏剂,无增敏PEG增敏胶乳增敏,透射比浊法和散射比浊法光路,检测器A,检测器B,IC,I0,I,I,透射比浊法,散射比浊法,透射免疫比浊法是在180角，即在直射角度上测定光透射强度。,散射比浊法在光路的596角的方向上测量散射光强度。,单色器,透射比浊计,散射比浊计,散射比浊和透射比浊的区别示意图,透射光散射光,散射光,透射免疫比浊法（transmission turbidimetry,原理,抗原与抗体在一定缓冲液中形成IC，当光线透过反应
13、溶液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。,透射免疫比浊法,溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm)溶液中形成的复合物分子要足够多 控制抗原抗体反应的温度和时间 加增敏剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标准曲线,反应要求,透射免疫比浊法,灵敏度较低。要求抗原抗体复合物分子应足够大、足够多，分子太小则入射光直接通过。加增敏剂。直线光路，灵敏度有先天缺陷。设计散射比浊。透射比浊是依据透射光减弱的原理来
14、定量的，因此只能测定抗原抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原抗体温育反应时间，检测时间较长。,缺陷,散射免疫比浊法,抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关,原理,单色器,散射比浊计,散射光,散射免疫比浊法,定时散射比浊分析,基本原理：免疫沉淀反应和散射比浊分析结合之技术，反应分两个阶段，预反应阶段和反应阶段,保证抗原不过量的方法：确保反应体系抗体过量 对抗原过量进行阈值限定,时间检测分两个,在预反应时段，加小量样本与抗原/抗体反应，测定第一次散射光信号值,加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号,信号峰值计算机处理转换为样品浓度,预反应
15、阶段5ul样本,抗原过剩区,阈值,信号,反 应 阶 段45ul样本,7.5秒,2分钟,定时散射比浊反应曲线图,抗原不过量抗原过量,散射免疫比浊法,速率散射比浊分析,基本原理：抗原抗体结合反应的一种动态测定法，适时检测抗原抗体复合物形成的散射光信号。是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态的速率比浊分析。当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低，即代表所测抗原的量。速率峰值一般在25秒时出现。在反应介质中加入一定量的促凝剂，可加速抗原抗体复合物的形成，以减少反
16、应时间。速率法的优点：是快速、不需要减去样本和试剂本底读数，校正结果也较稳定。,抗原浓度递增,散射光峰值,峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图,A,B,C,D,F,G,H,I,反应时间（秒）,0,60,85,散射率,抗体过量,抗原过量,第二峰值信号,粒子增强免疫比浊分析技术,基本原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后，当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。,特点：变非均相反应为均相反应，灵敏度提高（0.1ng/mL）；聚乙烯、聚苯乙烯等高分子胶乳颗粒，
17、直径100200nM;以物理吸附（多抗）或化学交联（单抗）方式与抗体连接；基于单抗胶乳免疫散射速率比浊技术的定量分析是发展方向。,光波,d,d 2d,当粒子直径小于入射波长时呈全透射，透射与散射相当,当粒子直径大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射，在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表复合物的量,特定蛋白分析仪简介,以免疫比浊法原理设计的特定蛋白分析仪有1970年 Immuno Preciptin）、1977年BEHRING公司开发的BL（(Behring Laser Nephelometer)）、而后该公司又先后于1985年研制出BN（Behring Nephel
18、ometer Analysers）、1987年研制出TTS（Turbi Time System）和1988年开发出BN-100（Behring Nephelometer 100），美国BECKMAN 公司也在80年代推出ARRAY360和ARRAY360E两种型号的特定蛋白分析仪，德国宝灵曼公司也同时推出 KeySys 特定蛋白分析仪，最近2000年 DADE BEHRING公司又将BN-100升级为 BN Prospec。,特定蛋白分析仪简介,当抗原（待测物质）含量过高时，可能出现前带现象，也就是钩状效应。此时，由于抗原、抗体比例不符合免疫反应的最适比例，而不发生反应，不能形成免疫复合物，造
19、成反应结果的假阴性。容易受待测标本，如血浆本身浊度的影响。当有明显脂肪血、黄疸或溶血时，本身就有一定的浊度，尤其在待测物质含量较低的情况下可造成假阳性。伪浊度的干扰。产生伪浊度的原因主要有（）抗体（试剂）的质量，如试剂中含有非特异性的交叉反应性抗体、试剂被污染或变质。（）试剂中填加的增浊剂浓度过高。（）反应时间掌握不当，如速率法反应时间过长，终点法时出现絮状沉淀。（）样品处理不当，如发生溶血。（）比色杯质量不合格或长久使用清洁度下降。,传统特定蛋白分析仪存在的问题,特定蛋白分析仪简介,速率信号的获取性能 抗原过剩的监测性能 胶乳粒子增强技术,技术改进,阈值,预反应阶段5ul样本,抗原过剩区,阈值,2分钟,抗原不过量抗原过量,反 应 阶 段45ul样本,小结,免疫比浊分析技术是传统免疫沉淀技术与比浊分析技术的结合免疫比浊分析技术主要有透射免疫比浊分析和散射免疫比浊分析两种速率测定和胶乳粒子增敏是免疫比浊分析的发展方向全自动生化分析仪和特定蛋白分析仪是免疫比浊分析的两个重要应用载体，均可实现全自动化分析,谢谢！,END,
