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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题2微生物的培养与应用,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、本课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,1、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有耐热的Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应（PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术
2、要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,一、研究思路,筛选菌株,统计菌落数目,设置对照,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：抑制大多数微生物的生长 造成有利于该菌生长的环境结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板划线法或稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,在此培养基中哪
3、些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,思考1,从物理性质看此培养基属于 培养基，是由于加入了凝固剂。从功能上看属于 培养基，此培养基的 只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于 培养基。,思考2该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是。,具有,只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长,选择,固体,琼脂,选择,氮源,思考3,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,
4、4、培养基选择分解尿素的微生物的原理,活学活用,1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C.固氮细菌、霉菌、放线菌D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌,C,（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C
5、代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,（二）统计菌落数目：,1.活菌计数法,（3）计算公式：,（间接计数法）,想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按以下公式进行计算。,旁栏思考题,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,实例分析P22,第二位同学的统计结果更接近真实值。因为第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具
6、有说服力。,你认为哪个同学的结果更接近真实值？,你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,都需要。第一位同学在该浓度下可以多涂布几个平板；第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与另外2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，可以在该浓度下重新进行实验。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布三个或三个以上的平板，培养统计菌落数，计算出菌落平均值。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一般以
7、三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右时为最好。,2、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,（二）.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。,（比例计数法，类似与标志重捕法）,待测样品,等量的已知含量的红细胞,混匀,涂抹,测定：,计算单位体积内的细菌数目,【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。,举例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为N mL的大
8、肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？,观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数红细胞含量/细菌含量（类似于标志重捕法）,公 式,W/Y M/X(每mL中）,NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X为：,2.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是()A.菌落数量最多的平板B.菌落数量最少的平板C.菌落数量适中的平板D.取若干个平板菌落数量的平均值,D,活学活用,设置对照的主要目的是排除实验组
9、中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,（三）设置对照：,设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素；条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。,教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种：一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实例：教材P23,教材提供的
10、案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种：一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实例：教材P23,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照实验的设置是必不可少的。,9,实验设计：,实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。,二实验设计与操作,下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料，进行实验设计，并写出详细的实验方案：,实验设计：,实验方案：,（一）土
11、壤取样,（三）样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察并计数,（六）鉴定,实验的具体操作,（二）制备培养基：,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度。原因：不同微生物在土壤中含量不同。目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。,（三）样品的稀释,特别注意的几个具体操作,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？,土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。,测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应
12、当有针对性地提供选择培养的条件。,旁栏思考题,保证获得菌落数在30300的平板进行计数。,稀释度,（四）取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,特别注意的几个具体操作,3.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板。B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
13、。C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时。D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数。,活学活用,D,4.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是()A.细菌个体小，真菌个体大B.细菌易稀释，真菌不易稀释C.细菌在土壤中数量比真菌多D.随机的，没有原因,C,活学活用,（五）微生物的培养与观察并计数,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。
14、细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,特别注意的几个具体操作,微生物的培养与观察,关注菌落的形状、大小、隆起程度、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,注意研究未知的微生物，一定要注意进行规范的无菌操作，以防被致病的微生物感染，实验后，一定要洗手。,（六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴定（鉴别）培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存。1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌是
15、否存在,2、伊红美蓝培养基：鉴定大肠杆菌是否存在,特别注意的几个具体操作,1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性2、伊红美蓝培养基：鉴定大肠杆菌。原理：代谢产物与伊红美蓝结合 菌落呈深紫色并带有金属光泽。,鉴定（鉴别）培养基的实例：,1.实验设计和操作提示,3 cm,选择,灭菌,选择,中性,尿素,对照,填一填,高,稀释度,10,90,1,9,0.1,平板涂布,低,火焰,103107,标记,3037,选择,多于,平均值,重新实验,稳定,30300,3,2个或2个以上,三、操作提示,无菌操作,做好标记,制定计划,四、结果分析与评价,（一）如何
16、判断培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,（二）如何判断样品的稀释操作是否成功？,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,（三）重复组的结果是否一致的判定方法：,四、结果分析与评价,课题小结,稀释涂布平板法显微镜直接计数法,目的菌株,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A
17、.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,课堂训练,A,C,D,4.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中
18、非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,（宁夏，15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使
19、蛋白质变性，还能_。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。,温度,酸碱度,易培养,生活周期短,灭菌,消毒,损伤DNA的结构,比例合适,鉴定(或分类),将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生。,灭菌,8,
20、当堂检测,1.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是()A.菌落 B.细菌形态 C.细菌体积 D.细菌结构,A,2.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是()A.将土壤用无菌水稀释，制备103106土壤稀释液 B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上 C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌 D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株,C,3.请选出下列正确的操作步骤()土壤取样称取10 g土壤，取出加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A.B.C.D.,C,
21、4.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是()A.筛选出能分解尿素的细菌 B.对分离的菌种作进一步鉴定 C.作细菌的营养成分 D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素,B,5.甘蔗是南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母菌发酵蒸馏成品(燃料酒精)。(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。,步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意_和，加琼脂后灭菌，制成固体平板。步骤3
22、：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤4：根据_，筛选出突变菌。,添加高浓度蔗糖(葡萄糖),调低pH,是否能在选择培养基上生长,(2)上述步骤2、3和4的依据分别是_。,5.甘蔗是南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗榨汁(蔗糖)酵母菌发酵蒸馏成品(燃料酒精)。(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：,步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意_和，加琼脂后灭菌，制成固体平板。步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤4：根据_，筛选出突变菌。,添加
23、高浓度蔗糖(葡萄糖),调低pH,是否能在选择培养基上生长,获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性,提供高糖和酸性的筛选环境；,课后练习,2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没
24、有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别大肠杆菌培养基,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,归纳提炼,1.选择培养基(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。(2)常见的选择培养基加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培养基可以分离固氮微生物。,石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项(1)为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取其平均值。(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,
