实验动物微生物学.ppt

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1、第三章 实验动物微生物学和寄生虫学及其质量控制,上海交通大学医学院实验动物科学部姚一康,第二节 实验动物微生物学 和寄生虫学等级分类,第三节 合格动物群中常见 微生物和寄生虫污染,*第五节 实验动物微生物学和寄生虫学质量检测,第一节 实验动物传染病流行的基本环节及卫生防疫,第一节 实验动物传染病流行的基本环节及卫生防疫,传染源,传播途径,易感动物,传染病流行的基本环节,一、传染源（1）人源性（2）动物源性引起传染的条件（1）要有病原性和一定的毒力（2）侵入体内的病原体要达到一定的数量（3）病原体要有适当的侵入门户,二、传播途径,（1）直接传染：健康动物与患病动物（包括携带病原体动物）直接接触而

2、感染。如狂犬病毒、猴B病毒、艾滋病病毒等。水平传播：实验动物群体中互相的传播。传播途径包括消化道、呼吸道或皮肤粘膜创伤等。如沙门氏菌常经消化道感染；仙台病毒常经呼吸道；布氏杆菌病常由配种直接感染等。垂直传播：由母体通过胎盘将病原体传给胎儿，例如支原体、细小病毒等。,（2）间接传播,非生物性传播：a、经空气飞沫、尘埃传播；b、以饲料、垫料传播；c、经饮水和饮水用具传播；d、经笼器具传播。生物性传播：a、节肢动物：苍蝇、蚊子、蟑螂、蚤、虱、蜱、螨等。b、野生动物：野生啮齿类动物，常携带各种病原体，例如携带流行性出血热病毒的野鼠污染实验动物的垫料、饲料。c、实验动物：从外部购入的实验动物，未经严格检

3、疫和隔离。d、操作人员不注意卫生防疫传染病原体；有些人兽共患病，也可经人传播给实验动物，例如结核、布氏杆菌病等。,切断传播途径是控制传染病的主要措施。,三、易感动物,与下列因素有关1）种类（品系、品种）2）年龄 3）营养状况 4）机体的抵抗力5）机体防御器官状况,传染源、传播途径和易感动物是传染病传播的三个基本环节，缺少任何一个环节，新的传染病就不可能发生，也不可能造成传染病在实验动物中的流行。而当传染病流行已经形成时，切断任何一个环节，流行即告终止。,传染源,传播途径,易感动物,疫苗接种和药物治疗是预防传染病的有效手段。但是实验动物一般不采取疫苗接种和药物治疗，主要由于实验动物的特殊性：1、

4、应用疫苗或治疗制剂可能干扰实验结果。2、经过治疗或免疫的动物，外表健康，但可能 是带菌或带毒者，可能成为潜在的传染源。3、对小型实验动物，治疗措施可能在经济上不适宜。,四、实验动物卫生防疫主要包括以下几个方面的内容：1、平时的预防措施 2、发生疫病时的扑灭措施 3、消毒措施 4、隔离措施,消毒灭菌主要方法,物理性灭菌消毒（1）高压蒸汽灭菌：饲料、垫料、器具等消毒。预真空蒸汽：131，4；一般蒸汽灭菌：121，20-25。（2）高热煮沸：器械、笼具、水瓶等消毒100(20min)。（3）干烤消毒：可达180-280(15min30min)。（4）火焰消毒：温度可达300，主要用于不锈钢 笼具、金

5、属器械、墙壁的消毒。（5）照射消毒灭菌：紫外线、-射线等，用于空气、饲料、垫 料和器具的消毒。（6）微波灭菌：工业微波炉，家用微波炉。小包装饲料。,化学消毒 是使用化学药物喷洒、浸泡、擦拭、熏蒸等，以达到消毒灭菌的目的。常用化学消毒方法包括液体消毒和蒸汽消毒。（1）液体消毒剂：包括石炭酸、过氧乙酸、来苏水、次氯酸等。（2）熏蒸消毒：包括福尔马林和三聚甲醛等。,第二节 实验动物微生物学 和寄生虫学等级分类,实验动物微生物学和寄生虫学等级分类,1.普通动物（conventional animal）CV2.清洁动物（clean animal）CL3.无特定病原体动物（specific pathoge

6、n free animal)SPF4.无菌动物（germ free animal）GF和悉生动物（gnotobiotic animal)GN,一、普通动物 conventional animal(CV),必须是不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体。,普通动物 饲育在开放环境里,使用的垫料和饲料,只消毒不灭菌;其饮水须符合城市饮用水标准。,普通动物只能用于教学实验和某些科研工作的预实验。,清洁动物clean animal(CN),必须是不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体，,又不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体。,亦称最少疾病动物,Minimal Disease

7、 animal(MD)。,清洁动物生活在屏障环境中。,所用的垫料，饲料，饮水，手术器械和用具等均应经过高压蒸汽消毒。,工作人员需穿无菌服装才能进行饲育或实验操作。,无特定病原体动物Specific pathogen free Animal(SPF),又不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体；,还不携带主要潜在感染或条件致病菌和对科学实验干扰大的病原体的动物。,不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体；,SPF动物的饲育通常是:先培育出无菌动物或悉生动物;然后,再将其后代转移到屏障环境内饲育繁殖建群。,无菌动物,germ free animal(GF)动物体内外无可检出的一切生命体

8、的动物。,此种动物在自然界中并不存在,必须用人为的方法培育。,无菌动物的取得和饲育环境,子宫摘除术（剖腹产）饲育在隔离环境（隔离器内）一切用品经过严格包装、严格灭菌后，通过传递仓送入隔离器通过手套进行间接实验操作,悉生动物 gnotobiotic animal(GN),动物体内外所携带的生命体是已知的。,此种动物原是无菌动物人为的将指定微生物丛定居其体内外。,GF、GN和SPF,实验动物微生物学分类模拟图,人兽共患病原体、动物烈性传染病病原体,动物主要传染病原体、对实验干扰大的病原体,条件致病病原体、影响实验德微生物,所有微生物,已知微生物,普通级动物 清洁级动物 SPF级动物,无菌动物 悉生

9、动物,不同微生物学等级的实验动物比较,实验动物微生物学标准,实验动物微生物学标准,小鼠应排除病毒项目,淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 汉坦病毒鼠痘病毒小鼠肝炎病毒仙台病毒 小鼠肺炎病毒呼肠孤病毒III型小鼠细小病毒小鼠脑脊髓炎病毒小鼠腺病毒多瘤病毒,Lymphocytic Choriomeningitis Virus HantavirusEctromelia VirusMouse Hepatitis VirusSendai VirusPneumonia Virus of MiceReovirus type IIIMinute Virus of miceTheilers Mouse Encephalo

10、myelitis VirusMouse AdenovirusPolyoma Virus,大鼠应排除病毒项目,汉坦病毒仙台病毒小鼠肺炎病毒呼肠孤病毒III型大鼠细小病毒RV株大鼠细小病毒H-1株大鼠冠状病毒/大鼠延泪腺炎病毒,HantavirusSendai VirusPneumonia Virus of MiceReovirus type IIIRat ParvovirusRat ParvovirusRat Coronavirus/Sialodacryoadenitis Virus,第三节 实验动物群中常见微生物 和寄生虫污染及其控制,一.普通级动物中弓形虫污染,二.清洁级动物中的仙台病毒和小

11、鼠肝炎病毒的污染,三.SPF级动物中绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌细菌的污染,弓形虫是一种人畜共患的寄生虫，小鼠，大鼠，地鼠，豚鼠，家兔和非人灵长类实验动物及猫，牛，羊，猪等都能感染。,一.普通级合格动物中弓形虫污染,弓形虫是细胞内寄生虫，根据不同发育阶段分为五型：滋养体和包囊出现在中间宿主体内，裂殖体，配子体和卵囊只出现在终宿主猫体内。,合 子,雌雄配子体,滋养体,经猫消化道侵入肠上皮细胞发育繁殖,危害性：弓形虫感染可引起肠粘膜和肠系膜淋巴，心、眼、肾上腺、脾、脑、肺、肝、胎盘及肌肉组织的坏死和损伤。小鼠感染后会严重影响实验结果。影响妊娠期胎儿发育。,在病畜和带虫者的肉、内脏、血液

12、、渗出液和排泄物中均有弓形虫，甚至从乳汁中也能分离出弓形虫，也可引起感染。,弓形虫污染的预 防,实验动物设施内要保持清洁，定期消毒。严格阻断猫及其排泄物对设施、饲料、垫料和饮水的污染。消灭野鼠，驱走野猫，不饲养一切宠物。,二.清洁级合格动物中的仙台病毒和小鼠肝炎病毒的污染,仙台病毒属于副粘病毒科,副粘病毒属。,现在认为:啮齿类实验动物是仙台病毒唯一自然宿主。,传播途径：仙台病毒除了鼻内途径外，其它途径均不引起小鼠的自然感染。,偶尔可在肾、肝、脾、等器官发现病毒，但在尿、血和肠内则没有病毒。,不同品系小鼠对仙台病毒感染的易感性和敏感性明显不同。,在自发性流行中抵抗力大的小鼠如SJL/j等死亡率接

13、近0，高度易感小鼠如Swiss裸鼠则可接近100。感染的裸鼠其疾病症状出现的时间比有免疫机能的小鼠稍晚，并伴有进行性消瘦。在较长的时间里陆续死亡。,普通级鼠群中仙台病毒感染是最难控制的病毒感染之一。,凡新引进的动物必须经8周检疫(检查引入动物和“哨兵”动物的病毒抗体)。,哨兵动物,一旦在屏障环境内的鼠群中检出仙台病毒抗体阳性，若不及时清除所有被感染动物，将导致屏障设施的失败。,防疫：两种方法,1.消灭已感染鼠群,重引符合标准的种鼠或用无菌技术剖腹取胎重建繁殖群。,2.暂停繁殖，在相对静止条件下保存这种非繁殖群直至感染消除(约2个月)，然后恢复繁殖。,小鼠肝炎病毒(mice hepatitis

14、virus MHV),属冠状病毒科，冠状病毒属，与人冠状病毒(普通感冒可有肺炎)，大鼠冠状病毒(新生大鼠肺炎)，大鼠唾液腺病毒(唾液腺，泪腺炎)同属。有多种毒株。,消瘦型肝炎病毒是实验小鼠最重要的病毒感染之一。,临床表现为肝炎，脑炎和肠炎。,多数情况下是亚临床感染或慢性感染。,呈世界范围性分布，无明显的季节性差异。,MHV传播方式有经空气和接触两种。,小鼠是唯一能自然感染MHV;通过脑内接种,可实验感染棉鼠,大鼠和地鼠,但兔和豚鼠无反应。,MHV是普通级实验小鼠难以清除的病毒之一。,唯有对小鼠进行剖腹取胎术,结合屏障环境内维持饲养,才能培育无MHV感染的清洁级以上小鼠。,必须注意MHV垂直传播

15、的可能性。,防疫 通过定期检测,有利及时发现屏障环境内的鼠群中鼠肝炎病毒感染。及时消灭被感染的鼠群,重新引进符合标准的种群。,同步交配代乳方法重建繁殖群。,用无菌技术剖腹取胎重建繁殖群。,暂停繁殖方法重建繁殖群。,同步交配-把MHV阳性鼠群中怀孕母鼠自然分娩的新生鼠在分娩后的24小时内传给符合标准的代乳鼠带乳。然后在代乳鼠3周龄,6周龄和12周龄进行血清学检测,可获MHV阴性小鼠。,暂停繁殖法：从感染群中移去所有新生鼠,离乳鼠和妊娠鼠。停止繁殖15周,可排除感染。,15周后出生的第一代新生鼠在34周龄MHV血清阳性,四周后因从母方获得的抗体衰退而血清阴性。,在第二代小鼠39周龄MHV血清阴性。

16、,三.SPF级实验动物中的细菌污染,2.金黄色葡萄球菌,3.肺炎克雷伯氏杆菌,1.绿脓杆菌,绿脓杆菌是动物和人类胃肠道的一种常在菌。,实验动物可经口咽和胃肠途径感染；,常可在小鼠的口咽部和肠道发现。,该菌可导致封闭群小鼠(Swiss-Webster)和近交系小鼠(C3H)斜颈和转圈症状，被看作是小鼠疾患的主要细菌病原。,对免疫环境遭受损害或抑制的宿主，绿脓杆菌可穿过局部淋巴环境和血管环境，导致致死性败血症。,由工作人员带入屏障环境。,在常规小鼠群的饮水器中能检到绿脓杆菌。,在温暖、潮湿的环境中(如SPF小鼠饲养室的淋浴更衣处)也常检到这种菌。,绿脓杆菌来源,要预防绿脓杆菌,就必须定期对SPF小

17、鼠进行微生物学监测，及时淘汰被感染的鼠群。,通过酸化(用盐酸调PH2.5)氯化(10ppm)饮水来预防饮水器对SPF小鼠的感染;,对屏障环境的淋浴更衣室常规进行彻底打扫消毒灭菌，并要求进入屏障环境的工作人员严格执行操作规程和个人防护用品的穿戴。,金黄色葡萄球菌,在小鼠皮肤和粘膜上，常检到致病的金黄色葡萄球菌和一般不致病的表皮葡萄球菌。虽然金黄色葡萄球菌还没有被广泛看作实验小鼠的原发性疾病，但有些文献中报道了其作为皮肤感染，淋巴感染或粘膜感染病原学因子。,小鼠自发性葡萄球菌感染与,幼鼠比成鼠易感。,无胸腺裸小鼠因缺少保护性被毛并缺乏T细胞而经常发生皮肤和眼窝的葡萄球菌感染。,屏障环境的操作管理有

18、关。,营养及,小鼠品系，,据对SPF设施的细菌学监测发现，从健康SPF小鼠分离的金黄色葡萄球菌的噬菌体型常与从动物管理员体表分离的品系一致。,通常不能治疗或根除金黄色葡萄球菌，,饲养人员和实验人员严格执行隔离措施和操作细则。,唯有通过定期检测及时淘汰患鼠；酸化饮水；饲料和垫料彻底灭菌；经常更换垫料；,防疫,克雷伯氏菌,人和动物的肠道常在菌，是与人和动物泌尿，呼吸道感染有关的条件性致病菌。,小鼠自发爆发的疾病临床症状是：食欲不振，弓背，被毛粗乱，打喷嚏及呼吸深快。,为了从受感染的小鼠中清除这种病原体，就需要进行剖腹产和严格的屏障环境操作、管理。,第五节 实验动物微生物学 和寄生虫学质量检测,一.

19、检测目的二.检测方法三.检测规则,一、检测目的,1.排除人兽共患病，确保从事实验动物生产的饲养人员和动物实验的科研或教学人员身体健康。,2.排除危害实验动物的常见病多发病，确保实验动物种群的健康，为生命科学研究提供合格的实验动物。,1对新引进的普通级动物进行检疫，防止人兽共患病原体或动物烈性传染病带入实验动物种群，或传播给实验人员。,2定期对生产繁殖的实验动物种群进行抽样检测，及时了解实验动物生产群体中微生物学和寄生虫学质量；必要时作出淘汰或降级处理。,3当实验动物种群发生传染病流行时，检出感染途径，提出控制或预防措施。,4对实验动物生产或实验设施进行静态和动态检测，及时掌握实验动物环境条件，

20、了解是否符合实验动物国家标准。,3.研究确定实验动物微生物学和寄生虫学等级标准的划分，和不同等级实验动物的微生物学和寄生虫学质量指标。,4.确保使用实验动物作检测的药品和生物制品的质量，保证进行动物实验的科学研究成果和各种动物试验结果的可靠性、准确性和重复性。,二.检测方法,原则1.国内外通用,比较成熟,便于交流。2.可操作性强，检测结果易判断，检测率较高。3.易实现标准化和规范化，便于推广。,国家推荐性标准,实验动物 微生物学检测方法14GB/T14926.114926.642001,实验动物 寄生虫学检测方法GB/T18448.118448.102001,1.实验动物病毒学检测方法,目前我

21、国对实验动物病毒学检测通常使用血清学方法，包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫荧光试验（IFA）免疫酶染色试验（IEA）血球凝集（HA）和血球凝集抑制（HI）试验,2.实验动物细菌学检测方法,通常采用细菌分离和培养方法。根据培养基上菌落特征，将分离到的可疑菌落作生化鉴定。,检测人员的实际工作经验，直接影响到其对检测结果的判断准确性。,对部分细菌，如沙门氏菌，支原体等已开展血清学方法检测。,3.实验动物寄生虫学检测方法,通常在光学显微镜下查找寄生虫的虫体、虫卵或孢子。对人兽共患的弓形虫，则采用各种血清学的方法进行检测。,三.检测规则,1.检测频率,以间隔23个月为宜。在实验动物的国家标准中，

22、即规定：每3个月至少检测1次。,病原体刚侵入实验动物群体时,较易分离到病原体;,而当流行趋于平静可能分离不到病原体,但特异性抗体的检出率上升。通常在23个月内，抗体检出率不会下降太大。,随着时间的推移，某些个体的抗体效价水平会下降，以及新生的非感染动物增加，使抗体阳性动物的检出大量减少。,2.取样数量,通常对于动物群体中感染率高的病原体，只需少量采样就能检出；而当感染动物比例低时，若不增加取样数量，就可能漏检。,因此，可根据实验动物群体中病原体的感染率决定取样数量。如病原体感染率为1，要检出感染动物至少应取样100只。,病原体检测取样数量,达标的实验动物须排除的病原体感染率应为“0”,取样数量

23、须达60-90%以上，其检测结果的可信度方可达到95-99%。,而啮齿类实验动物采样，通常都牺牲被检测动物;,且实验动物寄生虫学质量检测通常与微生物学质量检测同时进行，而病原体的感染率不可能相同。,因此,在标准中采用的取样数量和取样方法，将适当参考实验动物群体大小，兼顾绝大多数病原体的感染率，以决定取样数量;并规定取样点。,实验动物不同生产群体取样数,活体取样,对实验动物的活体取样未作规定。无特殊要求时，对鸡、兔、犬和猴的活体取样，可在生产繁殖设施内进行。,第十章生 物 安 全,一、生物安全的概念,针对生物医学专业或现代生物技术的开发和应用，造成对人体健康和生态环境的潜在威胁，而应采取的一系列

24、有效预防和控制的措施。,二、广义的生物安全,(1)人类的健康与安全;(2)人类赖以生存的农业生物的安全;(3)与人类生存息息相关的生物多样性，即环境生物安全。,野生动物所感染的各种微生物,生物危害,实验人员或饲养人员,生活环境的污染,生态环境、生物多样性存在着潜在着威胁,不合格实验动物所携带的各种人兽共患病的病原体,三、忽视生物安全的行为,1.午餐与标本同存于实验室冰箱内；2.在实验室内抽烟、进食、喝饮料；3.不戴手套清洗未消毒的玻璃器皿；4.穿着实验服去食堂午餐、到会场开会；5.随意使用来源不清，质量不明的动物进行实验；6.生物垃圾与生活垃圾混淆一起处理；7.坚持使用传统的超净工作台，不添置

25、生物安全柜；,超净台,级生物安全柜,级生物安全柜,四、超净台与生物安全柜,五、WHO对感染性微生物分类标准,六、中国对病原体危害性分级,生物安全实验操作的要求,第三章练习题,1.传染病和非传染病的区别是：。A传染病具有传染性和流行性 B传染病可引起动物死亡C传染病可影响干扰实验结果 D患病机体内发生特异性反应2被病原体污染的笼具、垫料、水、空气等，可认为是传染病传播的。A传染源 B传播途径 C传播媒介 D病源携带者 3.实验兔用兔瘟疫苗免疫后就不会爆发兔瘟流行，这是从 来阻断传染病的。A 传染源 B传播途径 C易感动物 D传播媒介4.传染病流行的三个基本环节是、和。,第三章练习题,5.根据国标规定，清洁级动物微生物和寄生虫质量每 月至少检测1次。A 1 B 2 C 3 D 4 6.在下列普通动物必须排除的病原体中，不属于人兽共患的病原体是。A.鼠痘病毒 B.沙门氏菌 C.弓形虫 D.流行性出血热病毒7.弓形虫感染宿主后的靶器官是。A.肝 B.脑 C.眼 D.无选择8.悉生动物来自于 级动物。A.无菌 B.SPF C.普通 D.清洁9.无菌动物是指。A.无任何可查到细菌的动物。B.无任何细菌的动物。C.体内外无可检出的一切生命体的动物。D.体内外无感染的一切生命体的动物。10.SPF级实验动物中常见的细菌污染是：、和。,结束,谢谢,