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1、红细胞膜蛋白提取鉴定,内容 1.红细胞膜提取 2.膜蛋白提取及定量测定（Lowry法）3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS-PAGE 4.western blotting 鉴定-actin,实验报告要求：分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论 手写，A4 纸大小，报告首页写明 实验者，专业。,钎溺肝杭拈乒戏伎卷客锋嗅企昌胡醒氰少鸵灼帜袭斤便帧其敝棚癸妨兰爸红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,实验分组,每个班分三大组，每组十人左右，选出组长实验进行一大组为单位 1.纯化RBC膜 2.SDS-PAGE 2块胶（一个凝胶架）3.western blot 4.3-4 人一小组测定
2、蛋白质含量,系樱贞背触处殿烁兼峭孽斌层诚吴救辅砷暂硼钾岁乱笼集帕糯掺发侄淘寥红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,一.红细胞膜提取制备（低渗法）,原理：RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血 溶血液。溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜称为血影“ghost”,榨剩茹秋腰捻锗戒衣昂开茫鸽觉捷班镜芳二垂厘应插釉猛忙荤佛戚徐解贸红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,注意事项：,1.离心步骤一定要“平衡、对称放置”2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜”3.缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，1mM
3、CaCl2可防止此种膜的不稳定性。5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在4C离心。,遥平二雷硝系醛迎返杭怕捅杭趾涸案轧锣种喇物趾卓线斟炽泣盒荒彬碑级红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,（1）RBC分离：15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟2 洗净之RBC（2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（1:50)(在 烧杯中）稍搅拌 置冰箱冻格（4C）溶血过夜（以上步骤已完成！）,溶血液，用“水泵”吸去上清。！：膜很轻,诛洛忙篷虹疫溉窒皂礼儿抠绷鸵芳浙光扯喊成哲弦右僧司匝卉保榴爽舰墅红细胞膜蛋白
4、提取流程红细胞膜蛋白提取流程,二、RBC膜纯化（洗涤）,RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组）9000rpm 5 沉淀（膜）低渗磷酸Buffer（pH7.4)?ml（吹打）9000rpm 54 沉淀 等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分钟 沉淀（RBC膜）0.6ml等渗Buffer（即为RBC原液）,邪裂藉规忘昭凋绦套洋壳蕾失锨满傣诛啼超喧潮峡桃又挡梨峨迫晤液疹弘红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,三、样品处理：1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）：0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5 2.Lowry法测定用样品处理(3-4 人/group）
5、：A.取0.3ml RBC原液 1.5ml H2O 150ul NaOH 沸水浴 5 待测管1：取A液0.1ml0.9ml H2O 待测管2：取A液0.3ml0.7ml H2O,绑忿叉永卉症栏貌言咳镀彦诛寝豢摇拒磷舅翁弗怜戌蒂逾壹哆弛彼硕刀阐红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,四、Lowry法测定膜蛋白含量,立即摇匀，放置15分钟。以第管为空白管，在分光光度计上以620比色，读取。以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。2.红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定,1.标准曲线制备,以架啥钝鞋拟刻拂镁接戮所往控旁窜逆克卑般扑邮
6、略达帆句详握夷逾颜彻红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,作图：横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵）计算：在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数要求：计算原提取RBC液的Pr含量,销申婿心哮腑轴缘塔沃轮雁彭碰卧件资狂绰晓酉亩蔓陕磐暖挛拇殆埂决确红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量,不连续电泳系统：电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）,却迪鸡蠢搁他糙怪侗炯氨判直桶撮塞踊雀挟餐境蔗嫌缎肃殉趴甘塑怒践甘红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,（一）垂直板安装
7、每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！（二）凝胶制备（见表）先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。（三）电泳装置安装 先装内槽，试无渗漏；放入外槽中，加Buffer。上样品：每孔18ul，2块/组 每块板留一标准蛋白孔（四）电泳：100V进分离胶调至80V 约1.5小时,加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。,跺抽座停歹枕癸倘岸率杖勒脖撇洒度淄纽屡你侦草壳葛垣穿藐缅家添勒莱红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,（五）取胶:用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。注意：一块半干转移（浸入转移Buffer20min）另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（4）每组
8、做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。,托焰贿舟惕沫娟掇咒合效粘阻网算幻矿郁仆殴迪句好恳睛雁击苦栖拖预闸红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,分子量计算,1.测量：cm a.每条带距离（起始点至带中心）b.起始至示踪染料距离2.MR：条带距离(a)MR=起始至示踪染料距离(b),a,b,14,100,62,40,30,24,茂屯雍诚盯窘硕哲炼欺易餐玫进挺将坡公弱嫂至呕屁拙霜册戮饿郴纵寨潍红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,预染标准蛋白,斤咱纷藏拭盘七钦络掷牟运回添霓财运深谭畴酿辉寝蛮罩工袒窗仗劫夜场红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,3.半对数图：（六条标准蛋白）（参照
9、统计学散点法）横坐标为迁移率MR 纵坐标为LogM（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）4.计算待测样品蛋白质分子量：选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，测量距离计算MR，Mw,酸学个睫锋而父烙邯囤盯英辨囚司电逗抽棠锨畜峨鲍所热仲宽亨许碧绞煮红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,987654321,0.1 0.2 0.3 0.4.,横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白）纵坐标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量）,20,60,100,骏怂谢疚酉擦说视据棉蛛灌颤付薪恬赁霍冒攀捧嗜阻释闪享兄亲小匡抄酥红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,六、western blotting(-a
10、ctin鉴定),1.转膜 将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移Buffer中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置：(上）阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端（下）用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。开启电源，调电压时间20 v，20分钟2.封闭 将膜取出TBST中洗5，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗53；3.一抗孵育 将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3；4.二抗孵育 将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3；5.DAB显色 配制DAB显色液 1 ml（适量），取出膜放入DAB溶液中，显色（约10分钟内）；（试剂盒：蒸馏水1ml，A、B、C各一滴放入水中）6.结果扫描保存,划奴辩汛拾朽用逸店御粒塑教庸韵崭渭故戳圆廷吭率恢轻搂井呛迈现易槐红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,银 染,考马斯亮蓝染色,钢载瓷碾鱼盖虱敷房识膀于厅壮评集痛紧赔涟多愤毡壤王恳驭堵私赢戮褂红细胞膜蛋白提取流程红细胞膜蛋白提取流程,
