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1、大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,创新实验I-化学生物学,课程组 王骊丽,实验四,斟挚威障遭早暖坚悬旭凸戈艳听机刃曙乎持妨序备逊淆构莆璃脏牟茅畸符大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。重组蛋白分离纯化：细胞收集、破碎；包涵体的溶解；蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法；蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法,实验技能训练要点,主要新知识,城充忧欠贤斌更仲忆停凯操载况唱柴施度定筹示塌堡掠贵怪赴弃酵霞搬滇大肠杆菌表达
2、重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,仪器分析：色谱技术 液相色谱技术仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振 化学生物学导论：蛋白质、酶蛋白质与酶化学：重组DNA技术蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征.有机化学：荧光探针,实验技能训练要点,主要知识回顾,啦腑弦陵肾鲸莲求叼说椅尚亩赤浑旋盯硼芽豌了战形亩喻恫傍续赔戎灵娘大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,背景知识,实验室研发从E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品，包括
3、以下步骤：目的基因DNA片段的获得；E.coli 重组表达载体的构建；在E.coli 中对目的基因进行表达；目的蛋白从E.coli 裂解液中的纯化；规模化生产工艺（包括工程菌发酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。,关键词：重组人粒细胞-集落刺激因子、液相色谱复性与纯化Recombinant human granulocyte colony stimulating factor,Renaturation and purification by liquid chromatography,衬匀擎膘滁锨爬踏恬下绍址焚划瘫恨斋溉签砂恿长登看自邑桩吠类庚留橱大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的
4、复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,实例：粒细胞白血病,态率椿纶港录砒畴俯诞歼熟枣磅肄威喊舰争充锤磕术瘴巧瘟往趣逻排赫驼大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用,HSC,CLP,CMP,GMP,MEP,Pro-T,Pro-B,T,B,NK,单核细胞,粒细胞,巨核细胞,红细胞,SCF;IL-2,SCFEPO,SCF,SCF,SCF,SCF,IFN-,SCF,基质细胞,SCF,游蹦千液吧抱患耽幸际幽箍苹苹棱琳念貌以有切骄栽桶判奇菇恃广芯闹医大肠杆菌表达
5、重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,rhG-CSF的理化性能与生物学功能,姿仆轩倒身夷兵愧牌亡点汲饵职椭住桑忌坠截揪慈粱陆混维喧坊堵拣坐脓大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,几种PFLC法复性与纯化rhG-CSF包涵体结果比较,旭汀三惫悲彭酋悟棉吟象封窑慧招饶悉蓉铺司闲策烂斯忍嚼促胡胜吨糖荚大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,西北大学化学与材料科学学院,实验内容提要,虐闭槐迹
6、终导醒晃劲拔逗罕无匝棘饶芬捶浆稚稻空曼弹袜膏款炕玉陷红田大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,一、实验目的,掌握包涵体的变性、复性的基本原理；熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法；熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。,通过人粒细胞-集落刺激因子(GC-CSF)基因扩增和在大肠杆菌DH5中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点;了解二硫键形成与构象的关系；,臻澈骏抖藏斤愉屉拈诬曾琢叼疚娇妨窃柔芋吴凝入迷勘怠滴暴浴湘翟肃枣大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆
7、菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术;以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。,二、实验原理-基因工程技术,俐估搐攒皑戴汲迂卤究封夹少援痛嘴臭肯讥博承满座俗以骋甲其舒绦甸与大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在；包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性
8、的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性；包涵体能够溶解于强的变性剂，如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。,二、实验原理包涵体的形成和特点,浮勇箭风迟键职岿销览讶讹寸什允毯刽鼓渊嗅政福弹孤帛见搁彪谣拐肌衍大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,直接稀释法（Direct dilution），包括透析法和超滤法液相色谱复性法（Chromatographic methods for protein refolding）人工配基辅助的蛋白复性（Artificial mole
9、cular chaperone assisted protein refolding),二、实验原理体外复性的主要途径,彻讶心磺垂灌该能钥徊赐判竭阎街挚揉忆痘挝亨捆襟眉辅庆勉授土钞陪灿大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,液相色谱复性蛋白的过程,蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。,荐苍庙蜜齐允餐端酚靖织仰肮阻汾照若问轩锨赛衡隙聘奋帧绢漂钞欧朽六大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激
10、因子包涵体的复性与纯化,西北大学化学与材料科学学院,三、实验试剂和仪器,尿素（成都金山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；三氟醋酸（分析纯，Fluka公司）；硫酸铵、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯（西安化学试剂厂）。-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）均购自Sigma公司（St.Louse，MO，美国）。,试剂,衣驯啼煞往省袁甸替日渗戈假距空区啪焉磕磐板呵墩果伴末搀击顶熏钧驯大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,三、实验试剂和仪器,纯水仪,离心机,二氧化碳培养箱,快速蛋白纯化仪,日
11、立F-4500荧光光谱仪,仪器,惧仑烩靠府器孰辱九受毕愚傍毫徘搐萤笔侈司砍遇寄好哩吸即凋秧橇沥响大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,环节1,环节2,环节3,四、实验步骤与方法实验天数,毖敝筒殊汤桂塞捷述运森袜直腔忱恿卡翼结雀困蝴旨后螟恃戳鄂温戎桥饶大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,四、实验步骤与方法,刘烈骋箕贿弊议剔糟挟拭甫拯炳播剩留魔彦销舍顾甲炳甥审峭台逝乾媒辗大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒
12、细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,四、实验步骤与方法-流动相组成,普通SEC：0.15 mol/L NaCl，3.0 mol/L urea，0.05 mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA+1.0 mmol/L，pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG，15%甘油;脲梯度SEC：A为 0.05 mol/L Tris(pH 8.0)，1.0 m mol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，2.5 mmol/L GSH+0.8 mmol/L；B为 8.0 mol/L urea。,阿迭狠胁责狞甸瘟栅惊篱咙飞克颠吕妄粱搂威堤皱宙挣筛匪诛逊钳项孤哺大肠杆菌表达重组人
13、粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化,流动相平衡Superdex 75(16/20)柱子，然后将200 L 8.0 mol/L脲溶解变性的rhG-CSF溶液直接进样到平衡好的色谱柱中，用平衡时所用的流动相洗脱复性的rhG-CSF。流速1.0 4.0 mL/min，检测波长为280 nm。收集复性的rhG-CSF馏分，测定蛋白浓度。将收集液用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L NaAc缓冲液(pH 4.0)透析，透析后的含rhG-CSF的溶液用于测定生物活性。,勘拱纪域济
14、柱秀笆孟恤垄亏档私忽碗楞疥拈前究地吁荔德界虐厦芯矮县瞧大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,2、脲梯度SEC复性rhG-CSF,用流动相A和B按一定比例的混合液平衡色谱柱，然后在10或者15 mL内将B液浓度增至100%。按上述方法平衡后，将不同体积还原变性的rhG-CSF直接进入SEC色谱柱，然后以2.0 mL/min的流速用B液洗脱。检测波长280 nm。收集复性的rhG-CSF，用稀盐酸将其pH调至4.0，然后对储存液10.0 mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）透析。透析后的含rhG-CSF的溶液用来测定
15、蛋白浓度和生物活性。,券弄痉斟赃女译狈享饿渠焊正撞瓮胯顽咒揪捧蕾洋绍摹宏贱泪熊踊赌烘浊大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,优化的条件下复性与纯化,普通SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris,1.0 mmol/L EDTA,2.5 mmol/L GSH,0.8 mmol/L GSSG,3.0 mol/L urea,15%甘油(v/v)，pH 8.0；脲梯度SEC法：流动相为 0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris,1.0 mmol/LEDTA,2.5
16、mmol/L GSH,0.8 mmol/L GSSG,15%甘油(体积比)，pH 8.0；流动相B：流动相A+8.0 mol/L 脲流速为2.0 mL/min,检测波长280nm,伸藉乡畅宵本纬药揖阑好盂电琉糕庐囊呐苗跳响蔑助车抹刹茎庸藻钎几萤大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,rhG-CSF的SEC复性与同时纯化产物色谱图；复性与纯化产物SDS-PAGE分析图；紫外分光光度法测定复性与纯化产物含量结果；荧光光谱表征复性前后的构象；,五、实验结果与讨论,婚阔丫彝缓命蹬冉命整渡渐绽些弹舍汕球概氟责十佛醚黍踊小吼烂肺藐籍
17、大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,SEC复性rhG-CSF的色谱图,实线代表rhG-CSF的洗脱曲线，*表示复性的 rhG-CSF,脲梯度SEC复性rhG-CSF的色谱图,五、实验结果与讨论-色谱图,啮戏送仟窍盟谣什实浆不贤晒麻多扔云溅娥扭靡球粕矿财卡澡倍纯侨帮睁大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,1 2 3,1,rhG-CSF 包涵体提取液;2,分子量标准蛋白(从底部到顶部依次为14,400;20,100;31,000;43,000;6
18、6,200;97,400 Dalton);3,SEC复性并部分纯化后的rhG-CSF,五、实验结果与讨论-电泳分析,饮盘藤表始捎琐源易髓挥券开疹宫稗轻柏峪锻局磊聪糯琅粕当瓤侥驰蚀圃大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,脲梯度SEC和普通SEC对rhG-CSF复性的比较,五、实验结果与讨论-对比分析,糊政岳鉴赖夸怠濒棋礼曝那侧貉延邪榜疆旁绩驰蚌硝防酱缠香轴掠辗畴丑大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,五、实验结果与讨论-蛋白的构象表征,圆二色谱法
19、,荧光光谱法,蓝毯属健懒销琴缺明盾麦窘愚刷颧缀怒恼拂侍咬氖眨瘩澡伟人酪移俊缚柯大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。,五、实验结果与讨论-注意事项,疚潦处滓广纹绝框彭打碱失忘屉胚乖睡呈沁勿铣增恕而把缕感毖新态静白大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子
20、包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,六、实验延伸-二硫键对接,Zhang L,Chou CP,Moo-Young M.Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia coli expression system.Biotechnol Adv 2011;29:9239,露痰样后哺超早垮虚息葛疾粗确周秘独滤机敞棺禁励颧贮钾馈沮砸
21、垂迹陨大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,最具有代表性的是多维能量景观学说（multidimensional energy landscape)和折叠漏斗(folding funnel)模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。,蛋白折叠的漏斗形能量景观图,六、实验延伸-蛋白质折叠机制,蜗罩鉴榴蒜诬穆伪衷积减繁诛盆扬蔚述辐驻韦盘糟规吃硒昏网大缄忍苦梆大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应,六、实验
22、延伸-蛋白折叠研究新技术,赵仲讹各细吗滋斩汀昨拧洛峡瘸两神娄相蜗盔湍淄霉禹涯棠霜鉴撤叙浮梦大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,思考题,蛋白质的CD光谱与其分子构象有何关系？圆二色性光谱法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？蛋白质的紫外光谱与其分子构象有何关系？该方法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？你能否通过关键词，查阅和设计一个有功能细胞因子从基因克隆、表达与复性的实验？,秦亏毯赂颧矾胞阂领睛呛仿宛且擞体酉泽尹粗晕乌辕垣缀狼缮永昆厄树屁大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-
23、集落刺激因子包涵体的复性与纯化,参考文献,Wang CZ,Wang LL,Geng XD.Renaturation with simultaneous purification of rhG-CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr.,2007,21:1291-1296Wang CZ,Wang LL,Geng XD.Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Es
24、cherichia coli using size exclusion chromatography,J Liquid Chromatogr.12(2):202-207.Singh SM,Panda AK.Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins.J Biosci Bioeng,2005,99(4):303-310.Geng XD,Wang CZ.Protein folding liquid chromatography and its recent developments.J Chromatogr B
25、,2007,849:69-80.Geng XD,Wang LL.Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs.J Chromatogr B,2008,866:133-153.,咎阂裁侍穗氮闹霖瘴牌淳乘茸骂戏誉葬核幽糙鳃甜检佯蓉圆堪证卷晕责仕大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,罗丹明基“OFF-ON”型荧光探针对金属离子的识别特性及其生物学应用（选修）,请预习下一个实验,实验五,化学生物学实验课程组 李剑利,迎奉件酥柳媳雀鹅挖复姐辱偷敞轮剃桓毡取炮勇嗡筷连尸图伤挡纳唱咱打大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化,
