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1、生化分析技术,农学院生物技术教研室,Analytical technology of biochemistry,生物大分子主要是指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在植物中广泛存在的生物碱、萜类、皂苷、纤维素、果胶等成分有一些特殊的性质，本章把它们也做为研究范畴。,第二章 生物大分子制备,2.1 概述,生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。,许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一
2、，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。,许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。,生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的。温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。,需要了解的生物大分子的物理、
3、化学性质,生物大分子的制备通常可按以下步骤,生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。生物材料的破碎和预处理。分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。产物的浓缩，干燥和保存。,要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：在水和各种有机溶剂中的溶解性。在不同温
4、度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力等。,注意植物的季节性、地理位置和生长环境。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。,2.2
5、生物大分子的前处理,制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料。,生物材料的选择,材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。,2.2.2 细胞的破碎,除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，
6、都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。,研磨：将剪碎的动物组织置于研钵中，加入少量石英砂研磨，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。,组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒20秒，停10秒20秒，可反复多次。,反复冻融法：将待破碎的细胞冷至15到20，然后放于室温(或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液
7、的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。3)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000-2000105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。,物理学方法,自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的
8、温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。2)溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。,化学与生物化学方法：,3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细
9、胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛），将酵母细胞悬于0.1mmol/L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中，加1蜗牛酶，在30处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨法联合使用。4)有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。,2.2.3 生物大分子的提取,提取,“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。这一过程
10、是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。,影响提取的主要因素,影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH值和提取时间等。,极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大，远离等电点的pH值，溶解度增加。提取时的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。,根据提取所使用的溶剂可分为：水溶液提取有机溶剂提取,水溶液提取,蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好溶解度大，是提
11、取蛋白质和酶最常用的溶剂。,盐浓度,pH值,温度,酶降解,搅拌氧化,影响因素,有机溶剂提取,一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，其中正丁醇在0时在水中的溶解度为10.5，40时为6.6，同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。例如植物种子中的玉蜀黍蛋白、麸蛋白，常用7080的乙醇提取，动物组织中一些线粒体及微粒上的酶常用丁醇提取。,有机溶剂提取,例如，胰岛素可溶于稀
12、酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.53.0，进行提取，这样就从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：6.8的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；选用pH2.53.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，却可除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。,有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。,2.3 生物大分子的分离纯化,由
13、于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。,常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,2.3 生物大分子的分离纯化,沉淀法,沉淀是溶液中的溶质由液
14、相变成固相析出的过程。此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,中性盐沉淀（盐析法）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，2040饱和度的硫酸铵可以使许多病
15、毒沉淀，43饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,中性盐沉淀（盐析法）,蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大
16、量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。,COOH,NH2,盐析原理,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,中性盐沉淀（盐析法）,常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了四倍。,不易引起变性
17、，有稳定酶与蛋白质结构的作用。价格便宜，废液不污染环境。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,中性盐沉淀（盐析法）,操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。,盐析的影响因素 蛋白质的浓度 pH值对盐析的影响 温度的影响,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物
18、大分子的分离纯化,有机溶剂沉淀法,有机溶剂对于许多蛋白质核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大。一方面降低溶剂介电常数，另一方面与水溶解破坏蛋白质水膜，引起沉淀。,有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,有机溶剂沉淀法,进行沉淀操作时，
19、欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V=V0(S2 S1)(100S2)式中：V=需加入100浓度有机溶剂的体积 V0=原溶液体积 S1=原溶液中有机溶剂的浓度 S2=所要求达到的有机溶剂的浓度 100 是指加入的有机溶剂浓度为100，如所加入的有机溶剂的浓度为95，上式的(100S2)项应改为(95S2)。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀的影响因素 温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性
20、越高。样品浓度：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的
21、倍体积为宜。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,选择性变性沉淀法,这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,等电点沉淀法,等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离
22、。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,Analytical technology of biochemistry,2.3 生物大分子的分离纯化,有机聚合物沉淀法,应用最多的是聚乙二醇（简写为 PEG)，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600020000的 PEG。本方
23、法的优点是：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。,Thomas Graham 1861年发明透析方法透析是生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。,2.3.2 透析,下面的内容你要了解,Analytical technology of biochemistry,透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分
24、子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。,透析的方法,透析的原理?,透析当然要用透析膜,有商品出售!,目前常用的是美国联合碳化物公司和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管,Analytical technology of biochemistry,透析膜含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。,专家提示,Analytical technology
25、 of biochemistry,检查透析效果的方法是：用1 BaCl2检查(NH4)2SO4用1 AgNO3 检查NaCl、KCl等。,Analytical technology of biochemistry,超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,超滤,Analytical technology of biochemistry,超滤所用操作压为4104 Pa7105 Pa，膜的平均孔径为10100埃，用于分离大分子溶质。,常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混
26、合物制成。,2.3.4 冰冻干燥,冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。,冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。,Analytical technology of biochemistry,1.3.5 样品保存,生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。,空气、温度、水分、pH、光线、时间
27、,影响因素,如何保存蛋白和酶？,通常要保存于520在70下保存则最为理想,低温保存,蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0下可保存2年，15下可保存8年。,制成干粉 结晶保存,在保护剂下保存,Analytical technology of biochemistry,回忆一下,第二章总论就了解这么多吧，现在我们回忆一下，在这里我们学习了哪些内容，哪些是我们应该记忆或者应该有印象的。,Analytical technology of biochemistry,生物大分子的制备,Analytical technology of biochemistry,
