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1、第十一章 细胞增殖及其调控,细胞增殖的意义细胞周期与细胞分裂细胞周期调控,细胞增殖的意义,细胞生命活动的重要特征之一,是生物繁育的基础。单细胞生物：导致生物个体数量的增加。多细胞生物：由一个单细胞（受精卵）分裂发育而来，多细胞生物繁殖基础。成体生物：主要取代衰老死亡的细胞，维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等。,1 细胞周期与细胞分裂,细胞周期(cell cycle)概述有丝分裂(mitosis)胞质分裂(cytokinesis)减数分裂(meiosis),1.1 细胞周期概述,细胞周期细胞周期中各个不同时相及主要事件细胞周期长短测定细胞周期同步化
2、,1.1.1 细胞周期,1.概念：细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分完成所经历的一个有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞。,2.细胞周期时相组成：间期（interphase）G1 phase、S phase、G2 phase M phase 有丝分裂期（mitosis）胞质分裂期（cytokinesis）,细胞沿着G1SG2MG1周期性运转，在间期细胞体积增大（生长），在M期细胞先是核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。,3.细胞周期时间不同细胞的细胞周期时间差异很大；S+G2+M 时间变化较小，时间长短主要差别在G1期；有些分裂增殖的细胞缺乏G1、G2期。,4.细胞分类 根
3、据增殖状况，细胞分为三类：连续分裂细胞（cycling cell）：如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。休眠细胞（G0细胞）：暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，如淋巴细胞、肝、肾细胞。终末分化细胞：不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞。,1.1.2 细胞周期中不同时相及主要事件,G1期S 期G2期M 期,1.G1期：与DNA合成启动相关，开始合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化合物、脂等，同时染色质去凝集。2.S 期：DNA复制与组蛋白合成同步，组成核小体串珠结构。,Experimental demonstration of the c
4、oordinated Synthesis of DNA and histones.,3.G2期：DNA复制完成，在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子。4.M 期：细胞分裂期，真核细胞的细胞分裂主要包括：有丝分裂和减数分裂。遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞。,1.1.3 细胞周期长短测定,脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法流式细胞仪测定法缩时摄像技术 可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。,标记有丝分裂百分率法原理(Percentage Labeled Mitoses,PLM)对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂
5、细胞百分数的办法来测定细胞周期。,有关名词TG1：G1期的持续时间；TG2：G2期的持续时间；TS：S期的持续时间；TM：M期的持续时间；TC：一个细胞周期的持续时间；PLM：被标记分裂期细胞占所有分裂期细胞的百分比；TDR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特异前体，能被S期细胞摄入，而掺进DNA中。通常使用3H或者14C标记的TDR。,测定原理待测细胞经3H-TDR标记后，所有S期细胞均被标记。S期细胞经G2期才进入M期，所以起初PLM=0。开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。,S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高
6、点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M，进入G1期。所以从开始出现M到PLM达到最高点的时间间隔就是TM。当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现LM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。从LM出现到下一次LM出现的时间间隔就等于TC，TC=TG1+TS+TG2+TM，即可求出TG1长度。,事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。,1.1.4 细胞同步化,自然同步化人工同步化选择同步化诱导同步化,1.自然同步化 多核体
7、：如粘菌只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。疟原虫也具有类似的情况。某些水生动物的受精卵：如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。,2.选择同步化有丝分裂选择法 使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿附着性低，轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，可获得一定数量的中期细胞。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害；缺点：效率低(占1%2%)密度梯度离心法 不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉
8、降的速度与其半径的平方成正比。优点：用于任悬浮培养的细胞，缺点：同步化程度较低。,3.诱导同步法DNA合成阻断法(G1/S-TdR双阻断法)最终将细胞群阻断于G1/S交界处。优点：同步化效率高，几乎适合于所有体外培养的细胞体系；缺点：诱导过程可造成细胞非均衡生长，个别细胞体积增大。分裂中期阻断法 通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点：无非均衡生长现象；缺点：可逆性较差。,胸腺嘧啶核苷(Thymine Deoxyribonucleoside),4.条件依赖性突变株的应用 将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某
9、一特定时期。,1.2 有丝分裂(mitosis),前期（prophase）前中期（prometaphase）中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase）,1.前期,特征1 染色质开始浓缩形成有丝分裂染色体：由两条染色单体构成。在前期末，染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为动粒。,特征2 细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体开始装配。特征3 Golgi体、ER等细胞器解体，形成小的膜泡。,2.前中期,特征1 核膜破裂成小的膜泡，这一过程是由核纤层蛋白中特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体。,特征2 纺锤体微管与染色体的动粒结合，捕捉住染色体。每个已复制的染色体有两个动粒
10、，朝相反方向，保证与两极的微管结合；纺锤体微管捕捉住染色体后，形成三种类型的微管。（动力/极间/星体微管）特征3 不断运动的染色体开始移向赤道板。细胞周期也由前中期逐渐向中期运转。,3.中期,特征1 所有染色体排列到赤道板(Metaphase Plate)上。纺锤体检验点(spindle checkpoint)：所有染色体的动粒都被动粒微管捕获时，染色单体才分离，细胞分裂向后期进行；否则分裂暂停在中期。,4.后期,特征1 排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向极运动。大致可划分为连续的两个阶段，即后期A和后期B。后期A：动粒微管变短，染色体产生两极运动；后期B：极间微管延长，两极之间的
11、距离逐渐拉长，介导染色体向两极运动。,5.末期,特征1 染色单体到达两极，到达两极的染色单体开始去浓缩。特征2 核膜开始重新组装。特征3 Golgi体和ER重新形成并生长。特征4 核仁也开始重新组装，RNA合成功能逐渐恢复,有丝分裂结束。,1.3 胞质分裂,动物细胞胞质分裂植物细胞胞质分裂,1.动物细胞胞质分裂,胞质分裂始于细胞分裂后期，完成于末期。在赤道板周围细胞表面下陷，形成环形缢缩，称分裂沟。,分裂沟的形成和收缩环有关。胞质分裂开始时，大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组装成微丝并相互组成微丝束，环绕细胞，称为收缩环。,2.植物细胞胞质分裂,植物细胞胞质分裂是在细胞内形成新的细胞膜和细胞壁而
12、将细胞分开，以形成细胞板的形式完成。,1.4 减数分裂,减数分裂概念与过程减数分裂的意义减数分裂特点脊椎动物配子发生过程,1.4.1 减数分裂概念与过程,概念 减数分裂是细胞仅进行一次DNA复制，随后进行两次分裂，染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂。过程,1.4.2 减数分裂的意义,确保世代间遗传的稳定性；增加变异机会，确保生物的多样性，增强生物适应环境变化的能力。减数分裂是生物有性生殖的基础，是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础保证。,1.4.3 减数分裂特点,前期I：细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期,细线期染色体呈细线状（单线），具有念珠状的染色粒。虽然染色体已经复制，但光镜下
13、分辨不出两条染色单体。在有些物种中表现为染色体细线一端通过端粒和核膜相连，另一端放射状伸出，形似花束，称为花束期。,偶线期(zygotene)同源染色体配对的时期，称为联会(synapsis)。同源染色体间形成联会复合体(synaptonemal complex,SC)。在光镜下可以看到两条结合在一起的染色体，称为二价体。每一对同源染色体都经过复制，含四个染色单体，所以又称为四分体。这一时期合成约0.3%左右的DNA，称为zyg DNA。,粗线期（pachytene）持续时间长达数天，此时染色体变短，结合紧密，在光镜下只在局部可以区分同源染色体，这一时期同源染色体的非姊妹染色单体之间发生交换的
14、时期。粗线期SC上具有与SC宽度相近的电子致密球状小体，称为重组节，与DNA的重组有关。这一时期合成少量的DNA，称为P-DNA。并合成减数分裂专有的组蛋白。,双线期联会的同源染色体相互排斥、开始分离，但在交叉上还保持着联系。植物细胞双线期一般较短，许多动物卵细胞中双线期停留的时间非常长。人的卵母细胞在五个月胎儿中已达双线期，而一直到排卵都停在双线期。鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及无脊椎动物的昆虫中，双线期的二价体解螺旋而形成灯刷染色体，这一时期是卵黄积累的时期。,终变期二价体显著变短。由于交叉端化过程的进一步发展，故交叉数目减少，通常只有一至二个交叉。核仁此时开始消失，核被膜解体。,联会复合
15、体SC由两条同源染色体沿纵轴形成，外观呈梯子状。SC 上有重组节，是交换发生的部位。SC在细线期开始装配，形成于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。联会复合体是减数分裂偶线期两条同源染色体之间形成的一种结构，它与染色体的配对，交换和分离密切相关。,前期I特点：,a.Electron micrograph of SC of human pachytene bivalent(K:kinetochore;arrow:recombination nodules)b.Schematic diagram of SC;c.Electron micrograph of SC after treatment w
16、ith DNase to remove chromasomal fibers.,同源染色体间遗传物质重组,产生新的基因组合。,遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两次，导致染色体数目减半。减数分裂前间期的S期持续时间较长，少量DNA没有复制。前期变化复杂，同源染色体配对、联会、重组，产生遗传多样性。第一次分裂时,同源染色体分开。减数分裂时间较长。,1.4.4 脊椎动物配子发生过程,2 细胞周期的调控,细胞周期调控系统的主要作用细胞周期检验点(Cell Cycle Checkpoint)MPFCyclin-Cdk复合物的多样性及细胞周期运转细胞周期运转的阻遏（细胞周期运转的负调控）,在适当时候激活细
17、胞周期各个时相的相关酶和蛋白,然后自身失活(正调控)确保每一时相事件的全部完成(负调控)对外界环境因子起反应（如多细胞生物对增殖信号的反应）,2.1 细胞周期调控系统的主要作用,2.2 细胞周期检验点,概念 细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制,主要是确保周期每一时相事件的有序全部完成，并与外界环境因素相联系。,2.3 MPF,MPF(Maturation-promoting factor,Mitosis-promoting factor)的发现及其生化实质Mitotic Cyclin-Cdk复合物与功能,2.3.1 MPF的发现及其生化实质,细胞融合与PCC(Premature chrom
18、osomal condense)爪蟾卵子成熟过程和MPF的发现MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶，由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependent protein kinase)形成的复合物：MPF=p34cdc2+cyclinB,2.3.1.1 细胞融合与PCC,概念 用M期细胞和间期细胞（G1、S、G2）进行融合，可以使间期细胞核出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝集、核膜破裂及核仁消失等，这种经过诱导，在间期细胞中形成的染色体产物称为早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome,PCC)。,PCC现象 Rao,Johnson将H
19、ela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集。,人M期细胞与袋鼠G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：提示M期细胞存在诱导PCC的因子；,G1期PCC为单线状：DNA未复制。S期PCC为粉末状：正在复制的DNA容易受损伤，是DNA断裂的结果。G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，推测M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即促成熟因子(MPF),2.3.1.2 爪蟾卵子成熟过程和MPF的发现,处于第六期的爪蟾卵母细胞，
20、需要激素刺激才能进行减数分裂，成为成熟的卵细胞（egg）。,注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF。,显微注射实验说明：成熟卵细胞中含有能促使卵母细胞成熟的因子：MPF；卵母细胞分裂前，MPF已经存在，但处于非活性 状态，称preMPF。,不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子（MPF）。,2.3.1.3 MPF=p34cdc2+cyclinB,2.3.2 Mitotic Cyclin-Cdk复合物与功能,CDC基因及CyclinCyclin&CDK
21、功能,2.3.2.1 CDC基因及Cyclin,1960s Leland Hartwell,1970s Paul Nurse 以芽殖酵母和裂殖酵母为实验材料，发现许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene,cdc)。裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突变型在限制温度下无法分裂；cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。,MPF=p34cdc2（或p34cdc28）+clyclin B 2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因发现细胞周期调控的关键因子的研究而荣获
22、诺贝尔生理医学奖。,2.3.2.2 Cyclin&CDK,Cyclin特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。作用：激活CDK，引导CDK作用于不同底物。已知30余种,cyclin在细胞周期的不同时期表达，从而激活不同时期的CDK激酶活性，表现为不同的调节功能。G1期：cyclinD；G1/S期：cyclinE；S期：cyclinA；M期：cyclinB（也包括cyclinA）。M期cyclin在N端含有一段由9个aa残基组成的特殊序列，称为破坏框，和泛素介导的cylinA、B的降解有关。,CDK CDC2与细胞周期蛋白结合
23、才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）。cdc2又被称为CDK1，其它CDK和它比较而命名。如：CDK2、CDK3CDK8等。,2.3.2.3 功能,启动细胞从G2期进入M期的相关事件,2.4 Cyclin-Cdk复合物的多样性及细胞周期运转,不同的周期蛋白与不同的CDK结合，构成不同的Cyclin-CDK；不同的Cyclin-CDK在不同的时相表现活性，影响不同的下游事件。G1/S的转化 S期，DNA当且仅当复制一次 G2/M期转化 M期由中期向后期转化,2.4.1 G1/S的转化,G1期 在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4,CDK6结合，使下游的蛋白质如
24、Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE,cyclinA和CDK1的基因。,G1-S期 cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过R点进入S期。,2.4.2 S期，DNA当且仅当复制一次,S期主要的CDK激酶为CyclinA-CDK2，它的活化为DNA复制所必需。,2.4.3 G2/M期转化,G2/M期的转化和CDK1-cyclinB激酶密切相关。CDK1-cyclinB激酶：MPF=p34cdc2（或p34cdc28）+clyclin B。cdc2蛋白在细胞周期中含量稳定，而CyclinB的含 量呈周期性变化，故CDK1-cyclinB激酶活性呈周期性变
25、化，在G2期晚期阶段达到最大值并持续到M期的中期阶段。,CDK1-cyclinB激酶使底物蛋白磷酸化，从而启动细胞从G2期进入M期的相关事件：如如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩；核纤层蛋白磷酸化使核膜解体；p60c-src磷酸化，使细胞骨架重排（纺锤体装配）；核仁蛋白磷酸化，核仁解体。,2.4.4 M期由中期向后期转化,在中期当MPF活性达到最高时，激活后期促进因子(anaphase promoting complex,APC)，APC介导cyclinA、CyclinB通过“泛素化途径”选择性地被降解，CDK1活性丧失，在前期被CDK1磷酸化的蛋白质去磷酸化。,泛素化途径的蛋白质降解过程 泛
26、素（ubiquitin，Ub）由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。,2.5 细胞周期运转的阻遏（细胞周期运转的负调控）,细胞至少通过两种机制阻遏细胞周期运转：周期调控系统组分停止合成：如G0细胞，大部分Cyclin和Cdk都消失。CDK抑制物（CDK inhibitor,CDKI或CKI），阻止Cyclin-Cdk复合物的装配或活性；,2.5.1 CDKI,CDKI对细胞周期起负调控作用，抑制Cyclin-Cdk复合物的装配或活性，而将细胞阻止在不同的检验点。如DNA受损后，细胞将停留于G1 Checkpoint 让DNA修复或者凋亡。如P21,DNA损伤和抑癌基因P53 抑癌基因（如p53、Rb）的表达产物对细胞周期起负控作用，是细胞周期正常运转所必需的。如DNA损伤后会诱导P53蛋白的活化；活化的P53作为转录激活因子诱导P21的表达；P21抑制G1期CDK激酶活性。结果细胞将停留于G1 Checkpoint，让DNA修复或者诱导细胞凋亡。避免带有受损DNA的细胞分裂，能抑制肿瘤的发生。,
