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1、红细胞残留的PBMC精确计数和活性分析一、PBMC精确计数和活性分析的重要性外周血单个核细胞（PBMC）在免疫学、传染病、肿瘤学、干细胞移植、恶性血液肿瘤以及疫苗开发等领域 被广泛的研究，尤其是在免疫学领域，PBMC细胞被用来监测在不同患者之间的免疫功能，其监测浓度、活 力、增值、细胞因子的功能，对于临床试验和细胞医学研究都是是至关重要的。PBMC通常从分离于全血或者采集于病人的脐带血，这个过程就需要使用淋巴细胞分离液从血浆，血小板， 和红细胞（RBC）中分离PBMC。分离之后，冷冻保存之前或者各种免疫分析都需要进行常规的活性和浓度 测验来验证样品的质量。其中一个重要的问题就是PBMC细胞分离
2、中红细胞的污染，PBMC样品中红细胞的污染会导致测量浓度和活 性的误差，这就需要通过进一步的实验来分析这些细胞，要解决这个问题，可以用RBC溶解来消除潜在的 RBC污染导致的问题。二、消除红细胞导致的计数误差的方法1、新鲜的人类PBMC样品残留RBC的鉴定用Cellometer Vision细胞计数仪明场图像计数15个分离的新鲜白细胞样品，独特的光学系统使得红细胞的双凹面可视化，因此PBMC和RBC被视觉化然后图像计数。因此PBMC和RBC可以被视觉识别，然后根据 图像计数。下图显示的是明场计数的PBMC样品，红色圈圈出双凹面的红细胞，蓝色圈圈出PBMCL J-fLU 4 %- -一UVISI
3、ON CBA调焦，红细胞双凹面结构明场图像荧光染料染PBMC确认，红箭头为双凹的红细胞，绿箭头为PBMC红色圈圈出红细胞，蓝色圈圈出PBMCRBC的污染程度用公式计算：污染率%=RBC计数/总计数X100%结果显示4个样品高度污染（超过30%），6个样品中度污染（介于10%-30%），4个样品低轻度污染（低于 10%）。2、AO/PI双染活/死细胞进行自动计数AO和PI是荧光核酸染料，检测细胞的活性。AO是一种细胞膜透过性染料，染总细胞，发绿色荧光，PI不 具有细胞膜通透性，染死细胞，发橙/红色荧光。当死细胞同时包含了 AO和PI，发生荧光共振能量转移， AO发散的荧光被PI吸收，因此，只有活
4、细胞才发绿色荧光。此外，成熟的血小板和红细胞是无核的，不能 被荧光染料着色，完全排除。AO/PI混合液20ul和白细胞样品20ul，按照1： 1的比例混合，通过Cellometer 细胞计数仪计数PBMC浓度。3、通过AO/PI检测PBMC细胞活力Sample A+ AO / PIto directly measure nucleated cellsfor Cellometer automated cell countingSample B+ Trypan Blueto visualize nucleusfor manual counting为了验证AO/PI双染法精确计数总PBMC，从全血中
5、分离了 5个新鲜的白细胞样品，3%的醋酸溶解，然后台 盼蓝染色人工计数对比AO/PI双染法样品A：加AO/PI，然后直接通过Cellometer双荧光细 胞计数仪进行自动计数样品B： 3%的醋酸裂解红细胞，然后台盼蓝染色，计 数。两种方法对比，结果显示，AO/PI双染法能够不用裂 解RBC进行总PBMC计数和活力分析。4、AO/PI双染色法排除RBC污染导致的计数误差使用血球计数板手工计数和AO/PI双染自动计数两种方法，进行15个PBMC样品的计数。其中手工计数的 操作者为经验丰富的计数方面专家，可以凭丰富的经验及不断微调显微镜焦距区分出红细胞和PBMC。Comparison of PBMC
6、 Count Using AO/PI Method to Manual Leukocyte CountA. Directly measure total nucleated cells using AO/PI staining end如右图所示，手工计数法为蓝色柱条，AO/PI双染自动计数法为绿色柱条。AO/PI双染法1. Stain fresh numan PBMC sample with AO/PI (SOuf cell sc没有受到高度RBC污染的影响，可以精确计2. Cciurd数PBMC。而手工计数需要靠经验丰富的操Mgr作者一个一个的判断红细胞和PBMC。此结3. R日ccir果显
7、示AO/PI双染自动计数和经验丰富的操4. cw口作者进行的手工计数计数PBMC的结果一致。Fi口如e同时，15个样本中分离的结果差异很大，count叩叶染的差异大ReSU，tS三、结语Comparable leucocyte counts PBMC samiB. Compare ,不同人尤其不同病人分离后红细胞RBC污;leukocyte counts are obtained between AO/PI and manual counting, for all thepleRBq污染极大的影响e耶噂甘样品的浓度和活性的精确性，RBC污染的程度在不同病人之间有差异，标准的 The difference PBMC处理protocol无法区分，只有AOPI双荧光自动细胞计数仪能够快速、高效、精确进行PBMC计数和活 the amount of力分析，有助于免疫学的研究。It is conclusive that AO/PI staining can eliminate the error induced by residual RBCs in manual counting method.
