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1、2023奥利司他对人胆囊癌细胞活性的影响摘要目的探讨奥利司他对人胆囊癌细胞活性的影响。方法采用实验研究方法。通过体外培养人胆囊癌NOZxGBC-SDxSGC-996细胞,筛选出高表达FASN的人胆囊癌NOZ细胞采用细胞增殖、细胞克隆形姗口蛋白检测实验，分析奥利司他对人胆囊癌细胞活性的影响。人胆囊癌NOZ细胞分组：加入培养基设为NoZ细胞对照组，加入培养基+10molL奥利司他设为奥利司他低浓度组；加入培养基+100molL奥利司他，设为奥利司他高浓度组。观察指标：（1）FASN蛋白在人胆囊癌细胞中的表达情况。（2）奥司利他对人胆囊癌NOZ细胞增殖的影响。（3）奥司利他对人胆囊癌NOZ细胞凋亡的
2、影响。正态分布的计量资料以xs表示,组间比较采用AVONA检验，两两比较采用最小显著差异法。结果（1）FASN蛋白在人胆囊癌细胞中的表达情况。Westernblot检测结果显示：FASN蛋白在人胆囊癌NOZxGBC-SDxSGC-996细胞中的相对表达量分别为0.570.06.0.120.04s0.100.023者比较差异有统计学意义F=115.67zP0.05）;NOZ细胞分另U与GBC-SDxSGC-996细胞比较，差异均有统计学意义（P0.05H2）奥利司他对人胆囊癌NOZ细胞增殖的影响。细胞增殖毒性实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组的吸光度分另!J为2.
3、340.12、1.570.08,1.070.13x3组比较，差异有统计学意义（F=205.88,P0.05细胞克隆形成实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组的细胞克隆形成数目分别为(25723)个、(15311)个、(8311)个，3组比较,差异有统计学意义(F=92.64,P0.05WeStemblot实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中CyClinQl蛋白的相对表达量分别为2.310.10、1.520.05.1.230.11z3组比较,差异有统计学意义(F=120.73,P0.05NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度
4、组中CDKd蛋白的相对表达量分别为L580.041.210.02.1.190.04,3组比较，差异有统计学意义(F=110.45,P0.05X(3)奥利司他对人胆囊癌NOZ细胞凋亡的影响。Westernblot实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中Bcl-2蛋白的相对表达量分别为1.070.03x0.360.03x0.150.02,3组比较,差异有统计学意义(F=1242.93,P0.05)oNOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中Bax蛋白的相对表达量分别为0.510.03、0.380.05.1.380.04,3组比较，差异有统计学意义(F=583
5、.51,P0.05结论奥利司他可以抑制人胆囊癌NOZ细胞的生长，促进其凋亡。关键词胆囊肿瘤；奥利司他；细胞增殖；细胞凋亡；细胞活性；周期蛋白；凋亡相关蛋白胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤，预后不良，中位生存时间仅为47个月1-5O近年来,胆道系统肿瘤的发病率和致死率呈上升趋势6-8o2020年，全世界有10万例胆囊癌新发病例和8万例胆囊癌死亡病例90手术是胆囊癌的主要治疗方法,而多数胆囊癌患者诊断时已为晚期，不适合行根治性切除术10o理论上，基于化疗的综合治疗是延长多数晚期胆囊癌患者生存时间的主要方法。目前吉西他滨是胆囊癌一线化疗方案中的主要药物之一，但其客观缓解率仅约为30%11-14o因
6、此，临床迫切需要探索胆囊癌肿瘤进展的分子机制，开发新的治疗机会。奥利司他是一种脂肪酸合酶抑制剂，被批准用于治疗肥胖症。已有的研究结果显示：奥利司他在多种肿瘤的体内和体外模型中表现出抗肿瘤活性,且对正常细胞没有明显的毒性作用15-16o本研究通过体外培养人胆囊癌细胞，采用细胞增殖、克隆形成和蛋白检测实验，分析奥利司他对人胆囊癌细胞活性的影响。材料与方法一、实验材料与方法采用实验研究方法。（一）实验材料人胆囊癌NOZ.GBC-SDxSGC-996细胞由上海交通大学附属新华医院胆道疾病研究所提供。DMEM培养基（货号为C11995500BT）购自美国GIBCO公司。细胞增殖毒性检测试剂盒（cellc
7、ountingkit-8,CCK-8胎牛血清、青霉素/链霉素（1%增强型化学发光试剂盒（货号分别为40203ES8040130ES76x60162ES76sSQ202）购自上海翌圣有限公司。奥利司他（货号为HY-B0218）购自上海皓元生物医药科技有限公司。4%多聚甲醛（货号为BL539A）购自上海晶矿生物有限公司。结晶紫染色液（货号为COl21）购自上海碧云天生物科技有限公司。-actinxFASN蛋白（货号分别为AC026sA19050）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;CDK-4抗体（货号为14400366）购自美国瑞博奥生物科技有限公司;Cyclin-Dl抗体（货号为#2978）购自美
8、国CST公司;Bcl-2.Bax抗体（货号分别为60178-1-Igx50599-2-Ig）购自武汉三鹰生物有限公司。（二）实验方法1细胞培养：人胆囊癌NOZ.GBC-SD和SGC-996细胞常规在DMEM培养基中培养补充10%胎牛血清和青霉素/链霉素（1%I并且置于37。（：，5%的CO2的条件下培养。细胞经过常规验证，保证没有支原体污染。2 .Westernblot实验：采用蛋白提取试剂盒和BCA定量试剂盒对细胞进行蛋白提取和定量，操作步骤参照试剂盒说明书，按照增强型化学发光试剂盒说明书进行显影。-actin抗体按1：IOooo稀释,FASNxCDKACyclin-DkBcl-2xBaX抗
9、体按1：1000稀释。以wctin为参照，分析目的蛋白的相对表达情况。3 .FASN高表达细胞的筛选：采用Westernblot实验，按照上述步骤分析FASN蛋白在人胆囊癌NOZ.GBC-SD和SGC-996细胞中的表达情况，选用高表达的胆囊癌细胞继续完成后续实验。4 .细胞分组：将高表达FASN的人胆囊癌NOZ细胞分为3组，仅加入培养基，设为NOZ细胞对照组;力口入培养基+10molL奥利司他，设为奥利司他低浓度组；加入培养基+100molL奥利司他,设为奥利司他高浓度组。3组细胞加入培养基后均继续培养48h,再进行后续实验。5 .细胞增殖毒性实验：采用CCK-8法。将对数生长的人胆囊癌NO
10、Z细胞接种于6孔板中，按照4的方法干预48h后，将上述3组细胞以1000个/孔均匀接种至96孔培养板中，每组细胞对应5孔细胞，于接种后96h按照说明书应用CCK-8法测量450nm波长的吸光度值。6 .细胞克隆形成实验将对数生长的人胆囊癌NOZ细胞接种于6孔板中，约24h待细胞完全贴壁后，按照4的方法干预48h后，将上述3组细胞以1000个/孔均匀接种于6孑版,每组细胞对应3孔细胞，约2周后弃去培养基采用4%多聚甲醛固定30min后再用结晶紫染色液染色30min后，用清水洗净结晶紫染色液，待水分干燥后进行细胞群落计数。二、观察指标(1FASN蛋白在人胆囊癌细胞中的表达情况:人胆囊癌NOZ、GB
11、CSD、SGC996细胞中FASN蛋白的相对表达量。(2澳利司他对人胆囊癌NOZ细胞增殖的影响：3组人胆囊癌NOZ细胞的吸光度、克隆形成数目以及Cyclin-Dl蛋白和CDKM蛋白的相对表达量。(3)奥利司他对人胆囊癌NOZ细胞凋亡的影响：3组人胆囊癌NOZ细胞中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相对表达量。三、统计学分析应用SPSS25.0和GraphPadPrism9统计软件进行分析。正态分布的计量资料以xs表示，组间匕俄采用AVONA检验，两两比较采用最小显著差异法。P0.05为差异有统计学意义。结果一、FASN蛋白在人胆囊癌细胞中的表达情况Westernblot检测结果显示：FASN蛋白在人
12、胆囊癌NOZxGBC-SDxSGC996细胞中的相对表达量分别为0.570.06、0.120.00.100.02,3者比较,差异有统计学意义(F=Il5.67,P0.001);NOZ细胞分别与GBCSD、SGC996细胞匕瞰差异均有统计学意义(P0.001z0.001GBC-SD细胞和SGC-996细胞匕瞰，差异无统计学意义(P=0.651二、奥利司他对人胆囊癌NOZ细胞增殖的影响(一)细胞增殖毒性实验细胞增殖毒性实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组的吸光度分别为2.340.12、1.570.08、1.070.13,3组比较,差异有统计学意义(F=205.88,P
13、0.001);NOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组比较，差异均有统计学意义(P0.001z0.001);奥利司他低浓度组与奥利司他高浓度组比较，差异有统计学意义(P0.001(二)细胞克隆形成实验细胞克隆形成实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组的细胞克隆形成数目分别为(25723)个、(15311)个、(8311)个，3组比较,差异有统计学意义(F=92.64,P0.001);NOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组比较，差异均有统计学意义(P0.001,0.001);奥利司他低浓度组与奥利司他高浓度组比较，差异有统计学意义(P
14、=0.0021(三)Westernblot实验1 .Cyclin-Dl蛋白。NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中CydinQl蛋白的相对表达量为2.310.10.1.520.05x1.230.11,3组比较,差异有统计学意义(F=120.73,P0.001NOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组比较，差异均有统计学意义(P0.001x0.001);奥利司他低浓度组与奥利司他高浓度组比较，差异有统计学意义(P=0.0072 .CDK-4蛋白。NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中CDK-4蛋白的相对表达量分别为1.580.04、1.210.02J
15、.190.04,3组比较，差异有统计学意义（F=IlO.45,P0.001NOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组比较，差异均有统计学意义（P0.001z0.001）;奥利司他低浓度组与奥利司他高浓度组比较，差异无统计学意义（P=0.575X三、奥利司他对人胆囊癌NOZ细胞凋亡的影响（一）Bd-2蛋白Westernblot实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中Bcl2蛋白的相对表达量分别为1.070.03、0.360.03、0.150.02,3组比较,差异有统计学意义（F=I242.93,P0.001NOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他
16、高浓度组比较,差异均有统计学意义（P0.001z0.001）;奥利司他低浓度组与奥利司他高浓度组比较，差异有统计学意义（P0.001（二）Bax蛋白Westernblot实验结果显示：NOZ细胞对照组、奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组中Bax蛋白的相对表达量分别为0.510.03、0.380.05x1.380.04,3组比较，差异有统计学意义（F=583.51,P0.001XNOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组比较，差异均有统计学意义（P0.001z0.001）;奥利司他低浓度组与奥利司他高浓度组比较，差异有统计学意义（P=0.005X讨论脂质代谢过程的异常与多种肿瘤的发
17、生、发展密切相关。目前研究结果显示：靶向脂质代谢治疗方案显示出良好的抗癌效果17-24o胆囊癌相关的临床和流行病学研究结果显示：肥胖症和超重与胆囊癌的高风险呈正相关25-26o胆汁多组学实验结果显示：脂质代谢异常可能是胆囊癌早期诊断的标志270上述研究结果提示异常脂质代谢可能参与胆囊癌的肿瘤发生和恶性进展。已有的研究结果显示：CH到捻子素可以通过靶向腺首酸活化蛋白激酶adenosine5,-monophosphate(AMP)-activatedproteinkinase,AMPK和(或)固醇调节元件结合蛋白1(sterolregulatoryelementbindingprotein,SRE
18、BP1)抑制脂质合成，增强胆囊癌对吉西他滨的敏感性280这为靶向脂质代谢成为胆囊癌有效治疗靶点提供了可能性。奥利司他作为脂肪酸合成关键酶FASN的抑制剂，已被证明可抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡，例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、黑色素瘤和肾癌等29-38o在前列腺癌、黑色素瘤、口腔癌等体内模型中，奥利司他也可抑制肿瘤生长39400鉴于在其他肿瘤中奥利司他的抗癌效果，并且也证实其在动物体内应用的安全性，本研究选择FASN表达较高的人胆囊癌NOZ细胞,探讨奥利司他对人胆囊癌细胞活性的影响。本研究结果显示：3组胆囊癌NOZ细胞的吸光度、细胞克隆形成数目比较，差异均有统计学意义。
19、3组间两两比较，差异均有统计学意义。这说明奥利司他可以呈浓度依赖性抑制人胆囊癌NOZ细胞的生长。CDKM蛋白和Cyclin-Dl蛋白为周期相关蛋白，在细胞增殖周期中起到重要调节作用。本研究结果显示：3组中Cyclin-Dl蛋白和CDKd蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义；NOZ细胞对照组分别与奥利司他低浓度组、奥利司他高浓度组比较，差异均有统计学意义。这说明奥利司他能够通过抑制Cyclin-Dl蛋白和CDKd蛋白的表达,从而抑制人胆囊癌NOZ细胞的增殖周期。奥利司他低浓度组Cydin-Dl蛋白与奥利司他高浓度组比较，差异有统计学意义；奥利司他低浓度组CDKd蛋白与奥利司他高浓度组比较，差
20、异无统计学意义。这说明高浓度的奥利司他主要通过抑制Cydin-Dl蛋白表达从而抑制细胞周期。Bcl-2蛋白和Bax蛋白均为细胞凋亡相关蛋白，Bcl2蛋白对细胞凋亡起抑制作用，而Bax蛋白能够促进细胞凋亡，细胞内Bcl-2与Bax比例的降低能够促进细胞凋亡41o本研究结果显示：3组胆囊癌NOZ细胞中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义。3组间两两比较，差异均有统计学意义。这说明奥利司他呈浓度依赖性抑制Bcl-2蛋白的表达,高浓度的奥利司他可以显著促进Bax蛋白的表达，且Bcl-2与Bax的比例呈浓度依赖性降低。这提示奥利司他可以呈浓度依赖性促进人胆囊癌NoZ细胞凋亡。本研究有以下不足：（1）未深入探究奥利司他作用于胆囊癌细胞的内在机制。（2）未在动物模型中验证奥利司他的抗肿瘤效果。（3）奥利司他影响细胞凋亡的实验仅在蛋白水平验证。笔者团队后期将在细胞水平中进一步选用流式凋亡实验，建立动物模型验证本研究结论。综上，奥利司他可以抑制人胆囊癌NOZ细胞的生长，促进其凋亡。
