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1、第三章 微生物代谢调节,代谢调节是生物在长期进化过程中，为适应外界条件而形成的一 种复杂的生理机能。通过调节作用使细胞内的各种物质及能量代 谢得到协调和统一，使生物体能更好地利用环境条件来完成复杂的生命活动。天然微生物是通过快速启动或关闭蛋白质（酶）的合成和有关的 代谢途径,平衡各代谢物流或反应速率来适应外界环境的变化。微生物代谢调节系统的特点：精确、可塑性强，细胞水平的代谢 调节能力超过高等生物。成因：细胞体积小，所处环境多变。,3.1基本代谢的调节,举例：大肠杆菌细胞中存在2500种蛋白质，其中上千种是催化正常新陈代谢的酶。每个细菌细胞的体积只能容纳10万个蛋白质分子，所以每种酶平均分配不
2、到100个分子。如何解决合成与使用效率的经济关系？解决方式：组成酶（constitutive enzyme）经常以高浓度存在，其它酶都是诱导酶（inducible enzyme），在底物或其类似物存在时才合成，诱导酶的总量占细胞总蛋白含量的10%。,微生物大致采用三种方式调节其初级代谢：,1.酶活性的调节2.酶合成的调节3.遗传控制,而为了生物工艺目标，常需要消除这些调节机制，使所需代谢产物过量生产。,3.1.1 酶活性的调节,一、代谢调节部位 1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞 2.通过酶的定位控制酶与底物的接触 3.控制代谢物流向,1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞如：只有当速效碳源或氮源
3、耗尽时，微生物才合成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶系统。,1）真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器各自行使 某种特异的功能；2）原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行使功能：与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上；蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上；同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。,2.通过酶的定位控制酶与底物的接触,1)可逆反应途径由同种酶催化，可由不同辅基或辅酶控制代谢 物流向：如:两种Glu脱氢酶：以NADP为辅基 Glu合成 以NAD为辅基 Glu分解 2)通过调节酶的活性或酶的合成量。关键酶:某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第一个酶。粗调：调节酶的合成量细调：调节现有酶分
4、子的活性 3)通过调节产能代谢速率。,3.控制代谢物流向：(通过酶促反应速度来调节),3.1.2 酶合成的调节,通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，是基因水平上的调节，属于粗放的调节，间接而缓慢。一、诱导作用（一）酶合成调节的类型1.诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。组成酶（固有酶）：不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：EMP途径的一些酶。,诱导物(inducer)：底物或结构类似物，如：异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
5、诱导作用的类型：同时诱导：诱导物加入后，微生物能同时诱导出几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂代谢途径的分段调节。,二、分解代谢物阻遏（catabolite repression）：当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,故又称葡萄糖效应。分解代谢物阻遏导致出现“二次生长（diauxic growth）”.直接作用者是优先利用的碳源的中间代谢物实质是：因代谢反应链中某些中间代谢物或末端代谢物的过量积累而阻遏
6、代谢中一些酶的合成的现象。,二者都是由调节基因编码产生特异性调节蛋白(regulatory potein)；它俩是一类低分子量变构蛋白，有两个结合位点，一个与操纵基因结合，另一位点可与效应物结合；当调节蛋白与效应物结合后，就发生变构作用，变构后与操纵基因的结合能力可提高或下降。（有活性可与O结合；无活性不与O结合）阻遏物:能在没有诱导物时与操纵基因结合的调节蛋白；阻遏物蛋白:只能再有辅阻遏物存在时才能与操纵基因结合。,操纵子学说概述：1、操纵子（operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作子和启动子。结构基因(structural genes)：是决定某一多
7、肽的DNA 模板，可根据其上的碱基顺序转录出相应的mRNA，然后再可通过核糖体转译出相应的酶;（编码蛋白质的DNA序列）启动子(promoter)：能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，是RNA聚合酶的结合部位和转录起点；（在许多情况下还包括促进这一过程的调节蛋白结合位点。）操纵子（operator）：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，是阻遏蛋白的结合位点，能通过与阻遏物相结合来决定结构基因的转录是否能进行；调节基因（regulator gene）：用于编码组成型调节蛋白的基因，一般远离操纵子,但在原核生物中,可以位于操纵子旁边,编码调节蛋白。,三、反馈调节,反馈：指反应链中
8、某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响。凡使反应速度加快的称正反馈；凡使反应速度减慢的称负反馈（反馈抑制）；反馈阻遏影响从支点到终点的酶。反馈抑制主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除。,1.反馈阻遏,2.反馈抑制,四、协调控制,3.1.3 代谢系统的分子控制机制,一、遗传控制,在一途径中胞内不同酶的含量是在变化的。代谢途径可分为两种极端的类型：一种是通道型，另一种是库存型。在通道型途径中某些中间体保持与蛋白结合的状态（局域化），有时组成超大分子的多酶结构，催
9、化某一代谢的连续步骤。这些中间体不能与中间体库自由交换。在库存型途径中所有中间体可以自由交换（扩散），它们在细胞内不与蛋白结合。因此，一种代谢物既可作为一种酶的基质又可作为效应物。,二、DNA结合蛋白：激活剂与阻遏物,三、二元调节系统,四、RNA水平的调节机制：衰减器模型,3.2 微生物次级代谢,菌体合成代谢的产物可根据它们与菌体生长、繁殖的关系分为初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物是指微生物产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。其生物合成至少有一部分是和与初级代谢产物无关的遗传物质(包括核内和核外的遗传物质)
10、有关，同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关。抗生素、色素、毒素等是与初级代谢产物(如氨基酸、核酸)相对产生的次级代谢产物。,一、次级代谢产物及其特征,(1)次级代谢产物是由微生物产生的，不参与微生物的生长和繁殖(2)次级代谢产物的生物合成最少也要有一部分是不参与次级代谢产物生物合成的遗传物质(质粒plasmid)，但参与与质粒有关的代谢途径。(3)它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。,(4)次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和生产期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。接种一定时间后细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，称为生产期。(5)一般都同时产生结
11、构上相类似的多种副组分。(6)生产能力受微量金属离子(Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+等)和磷酸盐等无机离子的影响。,(7)在多数情况下，增加前体是有效的。(8)次级代谢酶的特异性不一定比初级代谢酶高，次级代谢酶的底物特异性在某种程度上说是比较广的。因此，如果供给与底物结构类似的物质，则可以得到与天然物不同的次级代谢产物。(9)培养温度过高或菌种移植次数过多，会使抗生素的生产能力下降，其原因可能是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落之故。,(10)次级代谢在其一个系列当中与一个酶相对应的底物和产物也可以成为其他酶的底物。也就是说，在代谢过程中不一定非按每个阶段正确的顺序，一
12、个生产物可由多种中间体和途径来取得，因此也可通过所谓“代谢纲目”或叫“代谢格子”这一系列途径来完成。总之，微生物次级代谢，其目的产物的生物合成途径取决于微生物的培养条件和菌种的特异性。,二、微生物次级代谢与初级代谢及生物合成抗生素的关系,1从菌体生化代谢方面分析 许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。糖代谢中间体，既可用来合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，这种中间体叫做分支中间体。,2、遗传代谢方面分析 初级代谢与次级代谢同样都受到核内DNA的调节控制，而次级代谢
13、产物还受到与初级代谢产物生物合成无关的遗传物质的控制，即受核内遗传物质(染色体遗传物质)和核外遗传物质(质粒)的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制，因而产生了质粒遗传的观点。也有只由染色体DNA控制的抗生素产物。,三、抗生素产生菌的主要代谢调节机制,受DNA控制的酶合成的调节机制，包括酶的诱导和酶的阻遏(有终点产物的阻遏和分解产物的阻遏)。酶活性的调节机制，包括终点产物的抑制或活化，利用辅酶的酶活调节、酶原的活化和潜酶的活化。细胞膜透性的调节。,在抗生素的生物合成途径中，一方面抗生素本身
14、的积累就能起反馈调节作用。另一方面初级代谢产物的形成受到反馈调节，也必然影响抗生素的合成。,1碳、氮分解代谢产物的调节,碳分解代谢产物调节指能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶(包括分解酶和合成酶)的调节。分为分解产物阻遏和抑制两种。,葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝裂霉素等都有明显降低产量的作用。在初级代谢中，氮分解代谢产物调节，即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶(蛋白酶、硝酸盐还原酶、酰胺酶、脲酶、组氨酸酶)的合成。在次级代谢中，其阻遏作用也确实存在。在抗生素生产中使用黄豆饼粉就是由于它缓慢分解成有阻遏作用的氨
15、基酸和氨，防止或减弱氮分解代谢产物阻遏作用的结果。,2磷酸盐的调节,磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。其机制按效应剂说有直接作用，即磷酸盐自身影响抗生素合成，和间接作用，即磷酸盐调节胞内其他效应剂(如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP)，进而影响抗生素合成。已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯等32种抗生素的合成产生阻抑作用。,3细胞膜透性的调节,外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输，如发生障碍，则胞内合成代谢物不能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养物不能进入胞内，也影响产物合成，使产量下降。如在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输
16、入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。如果输入硫化物能力增加，硫源供应允足，合成青霉素的量就增多。,四、营养期(生长期)和分化期(生产期)的关系,次级代谢的一个特征是次级代谢物通常是在生长阶段(营养期)之后的生产阶段(分化期)合成。次级代谢产物的形成出现较迟，这或许是抗生素产生菌避免自杀的主要机制之一。产物的形成是在某些养分从培养基中耗竭时开始的。易利用的糖、氨(NH3)或磷酸盐的消失导致次级代谢物阻遏作用的解除。,五、次级代谢产物的生物合成,主要包含以下几步：1）养分的摄入；2）通过中枢代谢途径养分转化为中间体；3）小分子建筑单位（次级代谢物合成的前体）的生物合成；4）如有必要，改变其
17、中的一些中间体；5）这些前体进入次级代谢物生物合成的专有途径；6）在次级代谢的主要骨架形成后做最后的修饰，形成产物。,1.前体的概况和来源,定义：前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。前体与中间体区别：在于前者的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中中去，有时它们是指同一物质。,微生物次级代谢物大多数源自以下一些关键初级代谢物，它们是初级代谢的中间体，可作为次级代谢物的前体：,1.糖类；2.莽草酸和（或）芳香
18、氨基酸；3.非芳香氨基酸4.C1化合物；5.脂肪酸（尤其是乙酸和丙酸）；6.柠檬酸循环的中间体；7.嘌呤和嘧啶。,2.养分转化为中枢途径的中间体,糖通过分解代谢反应转化为较小的5C，4C，3C和2C。,3.芳香中间体,有许多次级代谢物的芳香部分是由莽草酸途径的中间体或终产物形成的。芳香氨基酸生物合成途径负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成。但是大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚多酮途径合成的。,4、经修饰的糖前体,一些氨基糖苷类抗生素的糖，大多数来自葡萄糖，其碳架以整体方式结合到抗生素中，经以下一些反应修饰为所需的糖：差向异构化，异构化，氨化，去羟基，重排（生成分枝糖），脱羧，
19、氧化和还原。有些次级代谢物完全由糖组成如氨基环多醇抗生素）而另一些糖以糖苷的形式存在于次级代谢物中。,抗生素生物合戌中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸作为甲基供体，通过甲基转移酶进行。而甲硫氨酸的甲基源自N5-四氢叶酸。由甲基化作用引入甲基通常出现在次级代谢物生物合成的最后一步。,5、甲基的来源,3.3 代谢工程,代谢工程的含义:DNA重组技术刚进入可行阶段不久，就出现了不少可用来说明这种技术在定向的途径修饰方面的潜在应用的术语。如分子育种（1981年），体外进化（1988年），微生物工程或代谢途径工程（1988 1991年），细胞工程（1991 年）和 代谢工程（1991年），尽管不同的作者提出
20、不完全相同的定义，这些定义均传达了与代谢工程的总目标和手段相似或递进的含义。,代谢工程的定义：把量化代谢流及其控制的工程分析方法与根据分析结果制定的遗传修饰方案付之实施的分子生物学技术结合起来，以反复分析、校验和修正的方式进行实际操作，改善微生物的产物形成的能力和微生物的细胞性能，从而满足人类对生物的特定需求的生物工程的分支。,1.代谢通量(物流、信息流）的概念,2.代谢工程的应用,提高目的产物的产量及其对主要原料的转化率；扩大细胞可利用基质（原料）的范围；扩大细胞生物合成的范围；改善工业生产中细胞的形态和生理性能；调整细胞合成、分泌不同代谢产物的产量分布；,研究和完善微生物代谢及代谢调节的知识；生物制药方面的应用；环境净化方面的应用；酶制剂、微生物多肽制品的进一步开发；用微生物生产动植物异源蛋白。,
