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1、）,显微镜的七种观察方法,按观察方法分七种,明场,暗场,荧光,偏光,相差,DIC,霍夫曼,显微观察方式,按观察方法分 7-1,1.明场:照明光直接通过聚光镜入射于试样，并透过试样后进入物镜并最终被观察到。,明 场,明场观察方式,常规观察方式应用领域：常规镜检、病理、染色标本优点：视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察缺点：透明标本对比度低，标本没有立体感,按观察方法分 7-2,2.暗场:照明光通过物镜外围射于试样，来自试样的干涉及衍射光进入物镜并最终被观察到。,暗 场,1 原理丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。2 特点观察到极其
2、微小物体，分辨率可达0.02 0.004 um(明场0.4um)”超显微“。3 缺点只能观察到物体存在、运动和外部形态不方便调节标本要求高（灰尘、盖片、载片）,4 应用：微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察等,按观察方法分 7-3,3.荧光:利用某些物质在受到了紫外光或短波长的光激发照射以后能够发射出比激发光波长长的荧光的特性的观察方法,荧 光,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发光化荧光,荧光的种类自发（固有）荧光 二次荧光,荧光的性质,吸收光，必需
3、有激发光源荧光波长激发波长（损失热能）荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,荧光显微镜的优点和用途,优点：检出能力高（放大作用）对细胞的刺激小（可以活体染色）能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光素荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体荧光等发荧光量的测定对物质定性、定量分析,荧光显微镜的种类 透射式,荧光显微镜的种类落射式,荧光显微镜的主要部件,透射式汞灯光源激发滤色镜吸收滤色镜暗场聚光镜,落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜,落射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,激发滤色镜,落射荧光显微镜的构造,荧光显微镜光源,汞灯光源:提供激发光(U、V
4、、B、G),氙灯光源：高峰值更宽，更稳定,荧光显微镜激发透镜组,激发滤色镜:激发波长选择,激发透镜组（激发块）:,T%,nm,BAND PASS,入射光,发射光,激发 滤色镜,分光 滤色镜,吸收 滤色镜,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜:荧光透过,阻挡杂光,分色镜:反射激发光,荧光透过,A 透过,A,A 反射,B,B 透过,B 阻挡,nm,nm,T%,T%,A,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜:荧光透过,阻挡杂光,分色镜:反射激发光,荧光透过,A 透过,A,A 反射,B,B，C 透过,nm,nm,T%,T%,A,C,滤色镜的选择,荧光素的特性,滤色镜的特性,激发,分色,吸收
5、,带宽对图象的影响,SWB:BP420-480,WB:BP450-480,WIB:BP460-490,NB:BP470-490,FITC+PI,多重染色标本的多色观察,FITC+Texas Red+DAPI,三色滤色镜的特性曲线,激发,分色,吸收,双重染色标本的单色和双色观察,WU,WIB,DUAL BAND,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,单色滤色镜的特性曲线,双色滤色镜的特性曲线,现行显微镜特点和各种滤色镜,自由组合 激发块,吸收滤色镜,激发滤色镜,分色镜,油镜应使用荧光油,物镜光栏的运用,光栏全开启,光栏适当关小,减少杂散光干扰,荧光的衰减,防衰减的方法使用
6、抗衰减剂选择衰减小的荧光素降低激发光强度降低标本中氧的浓度,有衰减的标本,使用抗衰减剂的效果,汞灯灯箱构造,灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮,按观察方法分 7-4,4.偏光:有些物质在两个呈一定夹角的偏光滤片之间可现呈鲜明的对比，或根据双折射性能和定向呈现颜色,偏 光,1 原理依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜,自然光（多振动面）,偏振器1,偏振器2,偏振光（单一振动面）,各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等,应
7、用：矿物质、化学物品鉴别鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体植物病理检验鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等,偏光显微镜主要用于检测矿石,地质大学会用到,特别是可以用来鉴定珠宝,另外可以检测生物内骨骼,这个我还没有遇见实例,还可以检测生物化学结晶,化学院用来观察结晶液像,其他在纺织物品化学成分上检测上,物理芯片上等,凡是观察双折射晶体会使用偏光显微镜。,按观察方法分 7-5,5.相衬（差）:利用光线通过分别处于聚光镜与物镜的一对互补的光环后产生干涉（强度叠加或减弱），即相位差转变成了光强差，从而可清楚观察到使原来不易看清的透明类样品（即相位物体，如活细胞）。,相 差（衬）
8、,相 差（衬）,1 原理利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差,共轭面：吸收光线，直射光通过,补偿面：相位推迟，衍射光通过,物镜相板,聚光镜环状光阑,2 特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3 缺点需要光强高切片不能太厚(510um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜,4 应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞),按观察方法分 7-6,6.DIC:照明光由微分干涉对比棱镜变为两束衍射光，并使样品高度差异造成在光路上的微小差异，而光路差异变为利用微分干涉对比棱镜和检偏振
9、器的明暗对比。有时也利用敏感色板（波长补偿片），加强了高度差异的颜色变化。,DIC,相衬,DIC微分干涉相衬,1 原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。,2 特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。,3 缺点需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂,4 应用：无色透明活体标本的细微结构，无色荧光标本，染色标本，显微操作等,按
10、观察方法分 7-7,7.霍夫曼:光线穿过设于聚光镜内的狭缝光阑后并经“相位物体”（透明体）折射，再经过专用物镜内的具有暗、灰、明三个区的一块滤光片，而最终使光线按折射角的不同呈明暗的变化，其所成的像也类似DIC那样具有浮雕效果。,霍 夫 曼,1 原理斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。,2.历史1975年，Robert Hoffman 博士发明2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品3.特点提高未染色标本的可见性和对比度；图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕；可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头)；可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织；聚光镜的工作距离可以设计的更长；RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察,4.缺点观察效果与标本方向密切相关操作较复杂必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜观察荧光效果不如明场物镜5.应用所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作,
