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1、1,样品前处理技术的 进展与应用,2,一、样品前处理的重要性,在化学分析中，样品前处理一个最常见的问题。据统计，人们常常将60%的时间花在样品前处理上。这不但不符合高效率的要求，而且烦琐的传统样品处理方法也直接影响到最后的分析结果。,3,1 样品前处理内容,样品前包括处理：样品采集和制备 1.1 一般液体样品的处理：（1）液体的转移（2）液体的稀释（3）液体的混合（4）标准物的添加,4,样品前处理,1.2 分离提取等其他处理(1)液-液萃取（2）蒸馏（3）液-固萃取（4）固相萃取（5）超声提取（6）微波法（7）超临界流体萃取（8）膜透析法（9）生物样品水解、蛋白沉淀（10）离心/过滤（11)蒸
2、发浓缩（12）消解,5,2 重要性-以农药残留分析为例,2.1 需要检测痕量或超痕量残留水平。2.2 待测样品污染源的未知性和样品种类的多样性2.3 同时进行多残留检测。2.4 结论：萃取、净化技术等样品前处理是残留分析的关键。因而选择适当的样品处理方法或多种手段联合使用，是成功完成样品分析的 基础。,色谱过程中的误差来源,标准曲线 9%,仪器 8%,色谱 7%,积分 6%,进样 6%,交叉污染 4%,样品处理 30%,操作 19%,色谱柱 11%,8,3 国际上前处理技术发展,80年代中后期，国际上针对传统萃取技术的不足，发展了固相萃取（SPE）技术和超临界流体萃取技术(SFE)；90年代以
3、来，又出现了固相微萃取技术（SPME）、液相微萃取（LPME）、基质固相分散萃取技术（MSPDE）、免疫亲和色谱技术（IAC)等新的萃取技术。,9,4 我国残留分析前处理现状,我国残留分析普遍应用的萃取分离技术还是索氏抽提、振荡提取和超声波提取等传统技术。样品需要量大、萃取时间长、有机溶剂量消耗大，导致大量有毒废弃溶剂的产生。结论：我国的残留萃取技术是制约残留分析速度和分析效率提高的瓶颈，无法满足快速、准确的分析要求。,10,二、样品提取技术理论,提取是一个复杂的过程，是被测组分、样品基质和提取溶剂（或固体吸附剂）三者之间的相互作用与达到平衡的过程。常用的有液-液萃取，液-固萃取，柱色谱萃取等
4、。,11,1 液-液萃取(LLE),1.1 定义：液-液萃取-利用被测物质在两种互不相溶液体中分配系数不同，从一种溶液中转移到另一种溶液中。1.2 萃取溶剂的选择（1）溶剂和样品基质不能混溶；（2）待测物和溶剂之间应有最大的分配比（3）溶剂必须不含有干扰分析的污染物（4）对检测器的响应值应尽可能小（5）保留时间和待测物应不相同（6）溶剂本身应毒性低且易于纯化。,12,1.3 液-液萃取的类型,（1）分次萃取-通常在分液漏斗中进行，将样品和萃取溶剂混合振荡，静置分层后，分出水相。一个样品可用若干份的溶剂进行多次萃取，以提高萃取率。（2）连续萃取-是将样品和溶剂在连续萃取仪器中自动混合，由于连续操
5、作，可减少乳化现象，节省劳力，重现性好。,13,1.4 液-液萃取优缺点,优点：（1）技术经典（2）设备器材简单（3）操作容易缺点：（1）易乳化（2）回收率不稳定（3）选择性差（4）人为因素影响大（5）有机溶剂用量大,14,1.5 乳化现象的防止措施,（1）在水相或者乳化液中加入氯化钠或硫酸钠，利用盐析作用加大两相间的密度差异.（2）于3500r/min离心后放置.（3）用玻璃棒机械搅拌，破坏乳化层。,15,2 液-固萃取,2.1 定义：液-固萃取-利用固态（半固体）样品基质中的待测物质在萃取溶剂中较高的溶解度，使其从样品中转移出来的过程。2.2 应用模式：索氏提取、超声萃取、微波萃取（MAE
6、）、超临界萃取（SFE）加速溶剂萃取（ASE）。,16,3 柱色谱萃取,又称层析技术。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等,17,3.1 柱色谱技术分类,（1）吸附色谱-利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。,18,（2）分配色谱-利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。,19,（3）离子交换色谱-利用被分离物质在离子交换树脂上的离子
7、交换能力不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。,20,（4）凝胶渗透色谱-又称排阻色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。,21,3.2 柱色谱的典型应用：（1）分离（2）净化（3）制备,22,三 样品提取净化方法及应用,23,1 固相萃取（SOILD PHASE EXTRACTION）,1.1 原理 固相萃取（SPE）是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于液相。当样品通过固相萃取柱时，分析物被吸附在固相
8、表面，其它样品组分则通过柱子。分析物再用适当的溶剂洗脱下来，达到与样品基体和干扰化合物的分离及富集目的。,24,1.2 固相萃取的特点,（1）取代传统的液-液萃取，不需要大量互不相溶的溶剂；（2）处理过程中不会产生乳化现象；（3）采用高效高选择性的吸附剂，使萃取选择性高，重复性好；（4）简化样品处理过程，减少费用。,保留 冲洗 洗脱,样品基质 冲洗溶剂 洗脱溶剂,1.3 固相萃取机制,1.4 固相萃取过程,分析物,干扰物,柱預处理,样品添加,柱洗涤,分析物洗脫,27,1.4固相萃取的过程,（1）吸附剂的预处理 为保证萃取良好的再现现性，固相柱在使用前必须用适当的溶剂清洗。-对固相柱进行活化，展
9、开碳氢链增加和分析物作用的表面积；-对固相柱进行清洗，除去柱上吸附的对分析有影响的物质加样前预处理好的柱子必须保持湿润,28,（2）添加样品 将样品加于固相萃取柱中，用正压或负压（常压）使样品通过柱子。样品的流速必须控制，一般在1.5mL/min。以离子交换为作用机理的萃取，速度要适当降低，以保证分析物有足够的时间与柱填料的离子交换官能团发生作用。,29,（3）固相柱的洗涤 用适当的洗涤溶剂有选择性地将吸附力弱的杂质洗涤下来，而留分析物于柱上。（4）固相柱的干燥 用自然或吹氮的方法使固相柱干燥。在非水溶性有机溶剂为洗脱剂或用GC分析时，柱的干燥尤为重要。,30,（5）分析物的洗脱 选择适当的溶
10、剂将分析物洗脱下来，用于分析或进一步处理。洗脱溶剂应满足：A:必须有足够的强度，以最小用量将分析物洗脱下来；B:必须有足够的选择性，尽可能只将分析物洗脱，而将吸附力强的杂质留在柱上。,31,1.5 固相萃取分离模式,固相萃取分离模式与液相色谱相同（1）正相（吸附剂极性大于洗脱液极性）（2）反相（吸附剂极性小于洗脱液极性）（3）离子交换,32,什么是极性,在化学中，极性指一根共价键或一个共价分子中电荷分布的不均匀性。如果电荷分布得不均匀，则称该键或分子为极性；如果均匀，则称为非极性。物质的一些物理性质（如溶解性、熔沸点等）与分子的极性相关。一个共价分子是极性的，是说这个分子内电荷分布不均匀，或者
11、说，正负电荷中心没有重合。分子的极性取决于分子内各个键的极性以及它们的排列方式。在大多数情况下，极性分子中含有极性键，非极性分子中含有非极性键。然而，非极性分子也可以全部由极性键构成。只要分子高度对称，各个极性键的正、负电荷中心就都集中在了分子的几何中心上，这样便消去了分子的极性。这样的分子一般是直线形、三角形或四面体形。,33,溶解性 分子的极性对物质溶解性有很大影响。极性分子易溶于极性溶剂，非极性分子易溶于非极性溶剂，也即“相似相溶”。蔗糖、氨等极性分子和氯化钠等离子化合物易溶于水。具有长碳链的有机物，如油脂、石油的成分多不溶于水，而溶于非极性的有机溶剂。熔沸点在分子量相同的情况下，极性分
12、子比非极性分子有更高的沸点。这是因为极性分子之间的取向力比非极性分子之间的色散力大。,34,（1）正相萃取,用极性吸附剂萃取极性物质。在正相萃取时目标化合物是否能够保留在吸附剂上，取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用。包括氢键、键、偶极偶极、偶极诱导偶极相互作用以及其他的极性极性作用。正相固相萃取可以从非极性溶剂样品中萃取极性化合物。,35,（2）反相萃取,通常用非极性的或极性较弱的吸附剂萃取中等极性到非极性化合物。目标化合物与吸附剂间的作用是疏水性相互作用，主要是非极性非极性相互作用，是范德华力或色散力。,36,（3）离子交换萃取,离子交换固相萃取所用的吸附剂是带
13、有电荷的离子交换树脂，所萃取的目标化合物是带有电荷的化合物。目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力。,37,1.6 吸附剂选择,（1）根据目标化合物性质和样品基体性质。（2）尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂，可以得到目标化合物的最佳吸附。（3）例如：萃取碳氢化合物时，采用反相固相萃取。当目标化合物极性适中时，正反相固相萃取都可使用。,吸附剂选择考虑的其它因素,（4）目标化合物在极性或非极性溶剂中的溶解度，这主要涉及淋洗液的选择；（5）目标化合物有无可能离子化（通过调节pH值），从而决定是否采用离子交换固相萃取；（6）目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键，如形成共价键，在洗脱时可能会遇
14、到麻烦；（7）非目标化合物与目标化合物在吸附剂的吸附点上的竞争程度，这关系到目标化合物与干扰化合物是否能很好分离。,遵循“相似相溶”原则，并满足下列求：1）对被测组分溶解度大；2)对干扰杂质的溶解度小；3）能有效释放被测组分；4)具有良好地解离蛋白或脂肪的能力；5）沸点适中（4080）、黏度小、毒性低、易纯化、价格低廉、并易于进一步净化处理。,1.8 洗脱溶剂的选择,1.9 常见SPE柱类型,极性柱：CN、NH2、PSA、20H、Si-等；非极性柱：C18、C8、C2、CH、CN、PH阳离子交换柱：SCX，PRS，CBA阴离子交换柱：SAX，PSA，NH2，DEA 共价型柱：PBA根据目标化合
15、物性质和样品种类，选用合适的SPE柱和淋洗剂,不同规格的SPE柱,正相(silica gel,almina,florisil,CN,NH2,Diol)反相(C18,C8,C4,Phenyl)离子交换(SAX,WAX,SCX,WCX),排放槽,收集瓶,SPE 柱,SPE 柱預处理,样品添加,柱洗涤,SPE 柱,排放槽,收集瓶,馏份洗脫,在线 HPLC 分析,45,1.10 SPE应用,复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集；例如，生物体液（如血液，尿等）、中药及其代谢产物的分析、食品中有效成分或有害成分的分析、环保水样中有机污染 的分析的样品前处理。,自动固相萃取仪,控制器,主机,SPE柱,
16、试剂,移液針,注射泵,样品,在线 SPE-HPLC分析,48,2 凝胶净化法（GPC）,2.1原理 根据多孔凝胶对不同大小分子的排助效应进行分离。样品在多孔凝胶柱中随着流动相的移动，待分离的组分沿凝胶颗粒间的孔隙移动，大分子移动路径较短，先流出色谱柱，小分子由于扩散进入凝胶颗粒内部，迁移路径长，后流出色谱柱，实现分离。,GPC 的原理,利用空间排阻（分子尺寸大小）进行分离,小分子通过树脂“球”中的孔,大分子不能从孔中通过,柱填料：Bio Beads S-X3(中性多孔的交联苯乙烯二乙烯基苯聚合物),50,2.2 凝胶色谱仪,利用凝胶渗透色谱（排阻色谱）的分离原理制造的商品化仪器。泵 流动相 样
17、品 凝胶柱 组分分离 大分子先流出 弃掉 小分子目标化合物后流出 收集,GPC 样品净化系统-手动,手动样品净化系统,GPC 样品净化系统-全自动,控制系统（可编程控制软件）自动进样/馏分收集系统柱子 溶剂输送泵UV检测器进样阀及柱通路阀,53,2.3 影响GPC分离效果因素,1）分子的形状和体积（2）芳烃类化合物(包括多环芳烃)由于与柱填料聚合物之间形成pi-pi健，所以洗脱时间较长。（3）不同的溶剂系统对凝胶的溶胀作用不同，所以采用不同的溶剂系统会得到不同的分离结果。,54,固相微萃取(Solid Phase Microextraction）,固相微萃取(SPME)是九十年代兴起并迅速发展
18、的新型的、环境友好的样品前处理技术，无需有机溶剂，操作简便。在一个简单过程中同时完成了取样、萃取、富集和进样，是对液体样品中痕量有机污染物萃取方面的重要贡献。,55,3.1 固相微萃取原理,吸附-在石英纤维萃取头外表面涂渍一层固定液。遵循相似相溶原理，待测物在一定条件下被溶解/吸附在固定液中，并在固定液和样品中介质中达到平衡。涂层上吸附的待测物的量与样品中待测物浓度线性相关。解吸采用热解吸GC测定。,56,3.2 SPME特点,（1）无需溶剂直接提取水溶液和固体基质中的挥发性和半挥发性化合物（2）不同吸附纤维满足多种应用需求（3）配合自动进样器使用，保证实验的精确度和准确性（4）可取代其他样品
19、浓缩技术（5）经济：每个萃取头可以反复使用50次以上。（最多达200次左右）,57,3.3 固相微萃取的分类,（1）直接固相微萃取（Direct-SPME）：将涂有高分子固相液膜的石英纤维直接插入样品溶液或气样中，对目标分析物进行萃取。经过一定时间达到分配平衡，即可取出进行色谱分析,58,3.3 固相微萃取的分类,（2）顶空固相微萃取法（HS-SPME）：石英纤维停放在样品溶液上方进行顶空萃取，不与样品基体接触，避免了基体干扰，同时提高了分析速度。,60,3.4 固相微萃取的操作步骤,（1）样品萃取 将SPME针管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中。推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头可以浸 入水溶液中（直
20、接萃取）或置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间大约2-30分钟。缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。,61,3.4 固相微萃取的操作步骤,（2）GC 分析 将SPME针管插入GC 仪进样口。推手柄杆，伸出纤维头，热脱附样品进GC 色谱柱。缩回纤维头，移去针管，完成全过程。,62,3.5 SPME技术关键,固相微萃取关键在于选择石英纤维上的涂层（吸附剂）。要使目标化合物能吸附在涂层上，而干扰化合物和溶剂不吸附。一般原则是：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。,63,其它影响因素：（1）液膜厚度及其性质的影响：石英纤维表面的固相液膜厚度对于分析物的固相吸附量和平衡时
21、间都有影响。液膜越厚，固相吸附量越大，有利于提高方法灵敏度。,64,（2）搅拌效率的影响：HS-SPME方法中分析物由液相向气相扩散仍是最慢的一步。通过搅拌，加快分析物由液相向气相扩散的速度，使顶空区分析物浓度增大，快速达到平衡。可提高分析的灵敏度。,65,（3）温度的影响：温度升高，扩散速度随之增大，同时升温加强了对流过程，因此升温有利于缩短平衡时间，加快分析速度。在使用SPME方法时应寻找最佳工作温度。,66,（4）盐的作用：在气相和液相间的分配系数 K 受基体性质的影响，当基体变化时，分配系数也会改变。在水溶液样品中加入盐（NaCl、Na2SO4等）后，水溶液的离子强度增大，K增大，使分
22、析物在水相中溶解度减小，在气相中浓度增大。（5）溶液pH值的影响 控制溶液pH值能够改变溶液的离子强度，也能改变有机物在水中的溶解度。,67,3.6 SPME应用,SPME在食品与生物样品上应用日趋增加。如：人乳中PCB 及DDT测定。0.5ml样品中加入0.5ml高氯酸（1M）和0.15g硫酸钠。顶空瓶密封后振荡混匀，置加热块上加热，搅拌。SPME纤维（涂渍85um polyacrylate）在顶空瓶里的气相中静置40min。萃取完成后吸附纤维插入GC进样口（280）10分钟使目标物从纤维上热解吸，色谱分析(GC-ECD或 GC-MS)。,自动SPME装置,Incubator for,heating and,mixing,Moving syringe,holder,Sample tray,69,四 样品浓缩方法,1 旋转蒸发仪2 氮吹仪3真空浓缩仪4离心真空浓缩仪,70,样品前处理技术发展方向,（1）快速（2）有效（3）简单（4）节约成本（5）良好的健康保护和环境保护（6）选择性和重现性好（7）最大的回收率（8）自动化（9）易于推广,Thank you!,
