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1、第五章,植物无性系的快速繁殖,植物无性系的快速繁殖,分五个阶段：第一阶段，无菌培养物的建立（外植体的建立）第二阶段，诱导外植体生长与分化第三阶段，试管苗的增殖和继代培养第四阶段，壮苗与生根第五阶段，小植株的移栽驯化,无菌培养物的建立,植物材料的准备源植物的预处理植物材料的采集植物材料的消毒无菌操作初代培养物初代培养建立起来的条件初代培养中易出现的问题及对策,源植物的预处理,为获得健康、无菌的植物材料，需要在材料采集之前进行预处理，即将源植株栽培在特殊管理的大田或温室，或进行室内盆栽如果必须从大田中采集植物材料，则须做到采集未休眠或绽放前带芽鳞的芽用塑料布包裹将用的茎段或植物体部分，待长成后采集
2、用最幼嫩的枝条将枝条采回后用流水冲洗。,植物材料的采集,选择植物材料应遵循的原则：1、外植体再生能力强；2、遗传稳定性好；3、外植体来源丰富；4、外植体灭菌容易。,植物材料的采集,植物材料的采集要考虑消毒的难易程度天气、季节、生长环境、生长状态、取材部位等培养目的组织培养中的反应性即植物材料自身因素对培养中生长和发育的影响，也就是培养的难易程度,培养目的,从培养目的讲苗木快速无性繁殖：多采用腋芽茎段、原球茎或茎尖（分生组织）作起始培养材料生产单倍体植株：多采用花粉(药)培养或未受精胚珠培养生产植物次生代谢物：常用活体中该天然物质含量最丰富的部位游离的细胞作起始培养材料,组织培养中的反应性,基因
3、型源植株年龄组织或器官的年龄生理状态健康状态取材季节生长条件取材位置外植体大小损伤外植体的极性和接种方法预处理,基因型,双子叶植物常比单子叶植物容易获得再生植株，而裸子植物的再生能力则非常有限 同属不同种，甚至同种不同品种，器官分化和植株再生能力也有很大的差异,源植株年龄,植物的胚性组织常具有较高的再生能力随着植物年龄的增加，其再生能力会随之而下降植物组织培养常选用幼龄植物的组织或器官作外植体,组织或器官的年龄,幼嫩柔软(非木质化)组织一般比年老的木质化的组织更易于组织培养在开花期，植物的再生能力都得到提高,生理状态,外植体的生理状态显著影响着细胞分裂状态一般而言，处于植物营养生长状态的外植体
4、比生殖生长时具有更强的再生能力,健康状态,从健康的植株上取材，培养成功的可能性显然远远大于不健康的植株。在为营养繁殖选取外植体时，源植株的健康状态对消毒的难易程度、培养的难易程度及再生植株的表现都有很大影响，所以要慎之又慎。,取材季节,从大田栽培或野生的植物上采集外植体时，要考虑取材时的季节因素冬季是否严寒(严寒有利于打破休眠)夏季是否干燥(水分供应不充足，就生长得差)生长季节是否光照充足(光照不足，营养物质贮备较少),生长条件,自然昼长和自然光照条件下生长的植物材料同温室中甚至试管中离体培养的植物的培养反应有所不同与大田植物相比，生长在温室中的植物更易伸长和黄化，在培养中也更容易再生,取材位
5、置,从树体上游分离外植体时，位置越靠上，不定根发生的可能性就越小，这是由于上部要比下部更为成熟按照植物生理学的观点，沿植物主轴，愈向上生长时间愈短，但其生理或发育特性则愈近发育成熟，也就愈可能形成花器官；而愈靠近下部则愈近发育上的幼态，不定根发生能力也愈强,外植体大小,离体部分愈大，就愈易诱导其生长和再生，同时添加的营养和植物生长调节物质的依赖性也有所下降分生组织越大，存活率越高，却对于脱除病毒不利，外植体愈小的旺盛生长的分生组织区域，病毒含量就越小或无，脱除病毒的机会也就越大切取大小不同的伤口面积同无损伤部分的比例也应加以考虑，因为它会影响到再生能力,损伤,损伤组织对培养反应影响大，因为损伤
6、区域可以扩大对营养物质和生长调节物质的吸收，同时也增加乙烯的产生,外植体的极性和接种方法,外植体的极性也显著影响着培养中的反应，极性同某些生理活性物质的浓度梯度有关外植体的接种方式有两种：有时极性方式直立，非极性方式倒置。有时非极性接种方式根和芽再生比极性接种方式更容易，也更快,预处理,原初外植体可通过预处理来改变其生理状态低温处理将外植体置于一定的溶液中(含糖、BA、GA3等或不同浓度的BA)利用注射的方法注入生长调节物质,植物材料的消毒,植物材料的消毒,外植体消毒的步骤：外植体取材 自来水冲洗 70酒精表面消毒（2060s）无菌水冲洗 消毒剂处理 无菌水充分洗净 备用,植物材料的消毒,茎段
7、、茎尖或叶柄、叶片表面消毒地下根茎消毒果实和种子消毒花药或未授精胚珠等消毒注：为了增强消毒效果，采用如下方法：将植物材料在灭菌前用清洁的流水(或自来水)冲洗0.52小时向消毒剂中加入1滴或数滴吐温(Tween)20或80，浓度为0.08一0.12，粘着剂可降低表面张力，更好地同材料表面接触在消毒过程中搅拌或振荡在真空中进行消毒，可使气泡排除，灭菌更有效多种消毒剂多次消毒处理或复合消毒处理,无菌操作,无菌操作室或接种室消毒工作人员的个人清洁卫生接种工作台、接种工具、容器等的消毒接种操作要领,初代培养建立起来的条件,保证无菌条件合适选择好合适的作物种类、品种及培养的部位选择好合适的培养基，激素及其
8、他添加物掌握适宜的培养条件技术过关,初代培养中易出现的问题及对策,污染操作污染分为细菌污染和真菌污染外植体自身带菌导致的污染由于表面灭菌不彻底或外植体内部带菌所致 褐变 褐变的概念及影响因素 褐变的防止方法,细菌污染,细菌污染表现：在培养过程中，在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发酵状。原因：主要是由于工作人员使用未经充分消毒的工具、或由于呼吸排除的细菌、或操作人员用手接触材料或器皿的边缘，使微生物落入培养基中，有时也会因剪取某一带菌材料后用具又未彻底灭菌，造成继续污染。,真菌污染,真菌污染表现：在培养过程中，一般35天发现菌丝，既而很快出现灰、白、黄、
9、绿等孢子。原因：空气污染以及取放瓶塞扬起的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成。,褐变的概念及影响因素,概念褐变是指培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。褐化的发生是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中蛋白质发生聚合，引起其它酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。影响因素基因型材料的生理状态培养基成分培养时间,褐变的防止方法,选择适当的外植体，掌握适宜的采芽时间外植体用流水冲洗30分钟以上，在接种前将外植体在无菌水中浸泡处理降低对外植体的切割损伤，或在无菌水中切割降低培养基中无机盐浓度；缺省生长
10、调节物质可减少酮类物质分泌和氧化使用液体培养基可以迅速稀释外植体伤口处分泌出的有毒物质在培养基中加入活性炭在培养基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP加入抗氧化剂如柠檬酸、维生素C、L半胱氨酸、硫脲在培养基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸钠连续转接到新鲜的培养基上有时可缓慢阻止色素的形成由苗芽基部光激活引起的褐化可通过将苗芽基部处于黑暗状态得以消除控制光温条件，避免过高,诱导外植体生长与分化,再分化过程的类型大体上可分为以下几类顶芽和腋芽的发育不定芽的发育体细胞胚状体的发生与发育原球茎的发育原球茎是一种类胚组织，可理解为缩短的、呈珠粒状的，由胚性细组成的类似嫩茎的器官。大部分兰
11、花的培养属于这一类型,顶芽和腋芽的发育,顶芽和腋芽的发育方式主要有以下两种无菌短枝型：又称节培法，或微型扦插法，是将待繁殖的材料，剪成单芽茎段，转入成苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成单芽茎段，继代又可成苗（图）。丛生芽增殖型：茎尖或带芽茎段在外源细胞分裂素的作用下会使休眠芽启动生长，形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状结构（图）。注：通过顶芽和腋芽发育再生植株这种方法为多数园艺家们所推崇，它不经过发生愈伤组织而再生，是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式,不定芽的发育,有两种情况一种是不定芽的产生不经过愈伤组织阶段，不定芽是从外植体受伤或没有受伤的部位直接分化出来，这种植株的再生方式，
12、称器官型。另一种是不定芽的产生要经过愈伤组织阶段，即从外植体上诱导出愈伤组织，从愈伤组织上产生不定芽的再生方式，称器官发生型。注：通过这种方式繁殖，繁殖率极高，同时也可创造有益的突变体。但极易发生变异，常常不能保持优良品种的遗传特性，在快繁中一般要避免此种器官发生方式。,试管苗的增殖和继代培养,植物材料在容器中培养一段时间后，往往需要转接到新鲜的培养基上去生长。因为：培养基消耗尽植物材料在培养容器中已占尽生长空间需进一步增殖(转到同样配方的培养基上)植物材料转入下一阶段生长或另一种器官分化(转到不同配方的培养基上)由于无机盐和琼脂浓度过高而导致培养基干化由于pH值下降而引起培养基流体化防止褐化
13、现象发生而转接,试管苗的增殖和继代培养,继代培养中易出现的问题玻璃化现象驯化作用 试管繁殖速率及其计算,试管苗的增殖和继代培养,试管苗继代培养过程中分化再生能力衰退 原因：1、愈伤组织培养逐渐丧失了成器官中心；2、内源激素的减少；3、染色体畸变。解决措施：增加外源生长调节物质；筛选具有形态分生能力细胞团；缩短继代时间；重新建立细胞系。影响试管苗继代培养的因素植物材料的影响培养基及培养条件继代培养时间长短季节的影响解决措施,培养产物的观察记载（P56）,1、愈伤组织诱导率（产生愈伤组织的外植体数/外植体总数）100%愈伤组织生长量培养一定时间后愈伤组织干重或鲜重接种时愈伤组织干重或鲜重2、胚状体
14、诱导率（产生胚状体的外植体数/外植体总数）100%3、芽分化率（产生芽的外植体数/外植体总数）100%4、发根率（发根芽数/培养芽数）100%,玻璃化现象,玻璃化现象(vitrification)是一种异常的生理现象。玻璃化苗是植物组织培养时出现的半透明状、畸形的试管苗其解剖特点为：整株植物矮小肿胀，呈半透明状。有时发育出大量短而粗的茎，节间很短或几乎没有节间。输导组织虽可看到，但导管和管胞木质化不完全。叶片厚而狭长，有时基部较宽。叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易折碎。叶表缺少角质层蜡质或蜡质发育不完全，无功能性气孔器。玻璃化叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织。,玻璃化现象,玻璃化现象产生的原因一般而
15、言，培养条件与玻璃化现象的发生有关.培养条件引起试管苗碳水化合物、氮代谢和水分状态等发生生理异常。降低和减轻玻璃化现象采取的措施增加琼脂和(或)糖浓度改善培养容器的气体交换改变培养基的大量盐类降低BA水平增强光照，适当降低温度避免采用容易产生玻璃化现象的琼脂种类采用液固两相培养基,玻璃化苗发生的机理,试管苗玻璃化的产生是由于内源激素乙烯在代谢调节中所起的关键性启动作用。试管苗在胁迫培养环境中，如水势不当，通气不畅、生长调节剂浓度过高、温度过高等，导致乙烯产生。培养瓶空气中过剩的乙烯抑制了试管苗体内乙烯的生物合成，但诱发了其它激素质和量的改变及酶类的变化；另外，培养瓶中气体组成的改变，也影响磷酸
16、戊糖途径、光呼吸途径的进行。,驯化作用,驯化作用是指原先依赖于某种生长调节物质而生长的培养物，经过一段时间的继代培养后，不再需要这种生长调节物质，即变成对该生长调节物质自养的培养物的现象 驯化作用一般并非是永久性变化，有时培养条件变化也会逆转驯化作用，所以驯化作用是外遗传变化。驯化作用可在继代培养中自然发生，也可人为地改变培养条件，可以诱导或逆转这种驯化作用。驯化作用可能是由于植物组织内对该生长调节物质的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保护所致，组织对生长调节物质敏感性降低也可能是一种原因，也不排除上述几个原因共同作用的结果。,试管繁殖速率及其计算,试管苗增殖速率有理论计算和实际计算两
17、种理论计算是以接种一个芽或一块增殖的培养物，经过一段时间培养看能得到多少个芽或苗，这样推算出理论上一年能繁殖出多少个苗实际计算是接种一个芽或转接一个苗，经过一定的实际繁殖周期，看实际得到多少个成苗，然后再换算成每个周期实际繁殖的数量,试管繁殖速率及其计算,试管苗理论上一年能繁殖多少，可用下面的简单公式计算：Y=mXn=m XnY=年繁殖数m=无菌母株苗数X=每个培养周期增殖的倍数n=全年可增殖的周期次数=365/每周期的天数,壮苗与生根,壮苗材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流，使太细弱的材料达到壮苗的目的生根（离体生根和活体生根）,离体生根,壮苗后的单苗转入生根培养基后即可生根。一般来
18、说，多数植物的生根只需要一次培养，但有少部分植物的生根必须经过多次培养才能达到目的。一般认为矿物元素浓度较高时有利于发展茎叶，而较低时有利于生根，所以多采用1/2或1/4量的MS培养基，全部去掉或仅用很低的细胞分裂素，并加入适当的生长素。,活体生根,又称试管外生根：芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养510天，然后在温室中栽入培养基质中，并辅以高湿度环境，即经常喷雾，几天后，芽苗可自行生根。,小植株的移栽驯化,试管苗的特点1、根与输导系统不通；2、在高湿、弱光和异养条件下分化和生长的叶，叶表保护组织不发达甚至完全没有，易于失水萎焉。试管苗叶光合作用能力极低。3、组织幼
19、嫩、结构较松散、细胞含水率高，机械组织不发达，容易发生机械损伤，对病虫害特别敏感,小植株的移栽驯化,一、试管苗炼苗1、瓶炼：试管苗在移植前必须对其进行高光强锻炼，同时将瓶口包扎物打开，使试管苗慢慢适应外界环境，让植株生长粗壮，增强小苗体质以提高移苗成活率，这个过程叫做驯化或炼苗。关键技术：1）生根培养基中培养的天数；2）生根的状态；3）炼苗时的光照强度；4）炼苗的时间；5）瓶苗开口也有技巧可言,小植株的移栽驯化,2、盘炼：从瓶中小心取出试管苗，在20度左右的温水中浸泡约10min，换水两次，将粘附于试管苗根部的培养基清洗干净，迅速栽在装有已经过消毒处理的基质的育苗盘中，喷淋透水，喷洒一定剂量的
20、杀菌药，然后放在干净、排水良好的温室或塑料保温棚中，保持较高的空气湿度，炼苗20天左右。关键技术：1）取苗时手要轻。如果培养基太干燥，可以先用清水浸泡一段时间；2）炼苗基质以疏松、排水性和透气性良好者为宜，且必须经过消毒处理；3）植苗入盘的时间，最好选在无风阴湿的天气；4）对于刚进行盘炼的小苗，要特别注意掌握光照；5）盘炼进行一周后，应该适当叶面追肥。,小植株的移栽驯化,二、移栽（一）大田移栽（二）容器移栽,小植株的移栽驯化,三、试管苗移栽后的管理1、保持小苗的水份供需平衡；2、控制温度；3、控制光照；4、菌类控制。,驯化方法与步骤,试管内生根(in vitro rooting)试管外生根(ex intro rooting)(瓶内生根或离体生根)(瓶外生根)将生根的微型插条在温水或杀真菌剂溶液中清洗粘附在基部的琼脂(培养基)移植于温室中适当的生根基质或生根塞中 此时的驯化条件：1、高的相对湿度 2、遮阳(随季节不同而异)3、调控光周期(随季节及植物种类而异)4、底部加温(在北方冬季驯化时)新叶形成后 1、不再底部加温 2、逐渐降低相对湿度直至温室中的水平 逐渐增强光照水平 置于正常的温室条件下 移植大田并适当遮阳 置于充足的阳光下,结束,丛生芽增殖和无菌短枝型,丛生芽增殖型发育方式,
