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1、液相色谱条件的分析和建立主讲人:李效宽日期:2010年11月地点：武汉,HPLC分离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件),不同类型样品的方法选择,色谱柱的选择,根据分离方式分类(1)正相色谱：SiO2；CN；NH2(2)反相色谱：C18；C4；C8；CN；NH2；苯基(3)离子交换色谱：阳离子官能团：SO3H磺酸基、COOH羧基等 阴离子官能团：R4N季铵基、-氨基等(4)凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（GFC）；油溶性凝胶渗透（GPC）(5)
2、其它类型：手性柱等,1.填料基质：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2.键合相：C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等 3.孔径：60-100A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备）6.长度：100、150、250、300mm,色谱柱选择,色谱柱填料选择,粒度均匀（3，3.5,5 um),粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾宽的pH 范围，可以有较大的调节自由度,色谱柱选择,长度：75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长内径：2mm,4.6mm,10mm粒径：3um,3.5um,
3、5um孔径：100A,300A,流动相选择,溶 剂 截止波长(nm)水 190 乙腈 190 甲醇 210乙醇 210异丙醇 210 正己烷 210 四氢呋喃 210 二氯甲烷 240 氯仿 240,甲醇和乙腈的紫外吸收图,线性范围和检出限度都有影响,不同混合溶剂的粘度比较,分离度（R1.5）和峰型（1.05T0.95）,可接受的分离条件K,可以接受的分离应该是1k20,or 2k10 better。K=(tr-t0)/t0T0指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间K 与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大则分析时间太长。,理论塔板数,分离度,w1,w2是峰1峰2的基线宽度W0.5,1,w0.5
4、,2是峰1和峰2 的半高峰宽,分离度与k（容量因子）的关系,所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10方法：有机相100%,90%,80%,70每减少10%,k值变化为2.53倍,分离度80%-70%-60%,分离度（48%-47%-46%),更换有机相,a:甲醇-水b:THF-水c:甲醇：THF:水,总结,1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受2 微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全3 更换有机溶剂MeOH,THF,CAN4 混合使用有机溶剂记录每一次条件变化对谱峰的影响,其他控制选择性的因素,流动相pH值柱温不同品牌色谱柱离子对试剂,流动相pH值,1,2 酸性化合物4,5碱性
5、化合物3中性化合物图中曲线的拐点为该化合物的pKapH57之间会有较好的分离，5附近比较稳定,流动相pH值,流动相pH值,pH值的影响(pka),一组苯甲酸(pka=4.2)同系物的分离情况A:pH 2.5B:pH 3.0C:pH 3.5D:pH 4.0,pH值的影响,pH值必须在该缓冲盐的pKa1以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差由此得出磷酸盐缓冲液可用于醋酸盐缓冲液可用于,方式不同柱效不同,色谱条件色谱柱：Kromasil C18 4.6250mm 5um，柱温：室温，波长：203nm流速：1.0ml/min 2.梯度：乙腈：水为流动相1.流动相：乙腈：水（22
6、：78）为流动相 0min 20:80柱效:11500 20min 40:60人参皂苷Rg1(样品)柱效:60000,柱温的影响,温度变化1度，Rt变化13%A:30B:35C:40D:45温度控制对定量分析很重要,更换色谱柱的影响,A C8柱B 苯基柱C 氰基柱,更换色谱柱的影响,A C8柱B 苯基柱C 氰基柱由于更换色谱柱会影响峰的次序，所以这是最后的选择,流速的影响,A 3um dpB 5um dpC 10um dp从左到右 1,2,4ml/min改变流速对分离影响不大，但可以缩短分析时间,填料及外型影响,Dp：2.5um,3.5um,5um,10um（柱压，理论塔板数）长度：20,30
7、,50,100,150,250mm（柱压，理论塔板数）内径：2.1,3.0,3.9,4.6 mm（线速度）,a 150mm P=1800psi b 250mm P=3000psi,柱长与柱压和RT成比例,改变粒度，长度，流速,150-mm l,3-m，1-mL/min,1250psi 100-mm,3-m，1-mL/min,825psi 100-mm,3-m 2-mL/min,1650psi,缓冲盐（离子强度调节）的影响,色谱柱：Dionex acclaim C18，5um，250*4.6mm流动相：CH3CN:(NH4OAc溶液,pH5.2）20:80检测波长：280nm 流速：1.0ml/
8、min1050mM浓度,检测器的影响,检测波长的影响,二.色谱条件的开发,色谱条件开发的目标,二高一低：专属性高、准确度高、成本低是一个色谱工作者追求的目标。在尽量短的保留时间内得到最佳的峰型、合适的分离度。,等度洗脱的特点,优点操作简单、方便重现性好缺点不适合某些复杂物质,梯度洗脱的特点,优点分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式,等度和梯度获得柱效不同,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，柱温：25，波长：203nm流速：1.0ml/min 样品：人参皂苷Rg1 1.等度：乙腈：水（22：78）为流动相2.梯度：乙腈：水为流动相 0mi
9、n 20:80 20min 40:60,等度和梯度获得柱效不同,柱效2.1万,柱效6万,艰难的选择,分离度分析时间系统压力在三者之间作出最符合实际情况的选择,快速寻找方法的起点,传统的建立方法模式需要较长的时间，100%，90%,现代仪器多为三元或两元泵系统，可以方便的在整个流程中自由的变化比例，因此可以通过探索性梯度运行来寻找最佳方法入口。,确定梯度运行的方法,设计一个30分钟的运行，推荐条件：250*4.6mm 5um1.0ml/min 甲醇0 min 5%30 100%35 100%,一个实例,tg 第一个谱峰和最后一个谱峰的时间差Tg 整个梯度运行时间tg/tg0.4 梯度tg/tg=
10、（28.6-18.3)/30=0.34，因此可以分别尝试,由梯度变换为等度,平均保留时间t=(18.3+28.6)/2=23.5陡度=(100-5)/30=3.17等度比例=5+3.17*23.5=79%,等度（79%)运行结果（考虑K?）,由梯度变换梯度(K?),第一个谱峰18.3对应5+3.17*18.3=63%(18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1(K=1)最后一个谱峰28.6对应5+3.17*28.6=95%梯度时间为100-5=95-42 30 X X=16 min,陡度不变,第二次梯度运行结果,Time B%0 4216 9520 95,液相色谱的方法开发,（
11、二）梯度方法,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度一般方法,梯度洗脱的可变参数,梯度的陡度梯度的变化形状,如不用梯度：分离不理想,梯度条件的优化,梯度曲线的变化凹线,梯度曲线的变化凸线,梯度方法开发实例-第一步,开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。,梯度方法开发实例-第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。,梯度方法开发实例-第三步,从空白梯度图显示，在同样的色谱条件
12、，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。,梯度方法开发实例-第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。,梯度方法开发实例-第五步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。,梯度方法开发实例-第六步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。,梯度方法开发实例-第七步,最后用50-90%B，曲线4，得到好
13、的结果。,色谱应用实例欣弗事件,色谱柱：Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um（国家标准）流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用磷酸调pH值至2.5)-乙腈检测波长：210nm 柱温：25 流速：1.0ml/min,克林霉素磷酸酯,775225,8218,色谱应用实例欣弗事件,色谱柱：Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um 流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用40%氢氧化钾调pH值至5.6)-乙腈(775225)为流动相 检测波长：210nm 柱温：25 流速：1.0ml/min 分离度大于6,克林霉素磷酸酯,克林霉素,
14、色谱应用实例【三聚氰胺(牛奶事件),色谱柱：Venusil ASB-C18 4.6*250,5um;（FDA标准）流动相：(10mM 柠檬酸，10mM 辛烷磺酸钠，调pH 为3.0)：乙腈=85：15检测波长：240nm 柱温：40 流速：1.0ml/min分 子 式：C3N6H6、C3N3(NH2)3 分 子 量：126.12 含氮量：66.6%,色谱应用实例（紫杉醇 注射液）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm（黄金植物）流动相：乙腈-水（40：60），洗脱至主峰出完（约27分钟），然后以每分钟1.6%的速度增加乙腈的比例，25分钟后，乙腈比例增至80%，再以
15、每分钟4%的速度降低乙腈的比例，10分钟后，乙腈比例降至40%，保持此比例10分钟。检测波长：227nm 流速：1.0ml/min,紫杉醇,色谱应用实例（紫杉醇 注射液）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm流动相：甲醇-水-乙腈（30：40：30）检测波长：227nm 流速：1.0ml/min,炔诺酮,紫杉醇,色谱应用实例（血塞通崩解片）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：203nm时间（min）乙腈 水0 20%80%20 40%60%21 20%80%26 20%80%,三七皂苷R1,人参皂苷Rg1,人参皂苷Rb1,色谱应
16、用实例（胆酸钠原料）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：205nm时间（min）乙腈 0.2%磷酸二氢钾溶液(磷酸调PH值至2.5)0 25%75%30 40%60%40 40%60%50 25%75%,指纹图谱,色谱应用实例（抗生素）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：254nm流动相：乙腈：（三乙胺14ml，加水100ml,醋酸调PH值至2.5)=18：82流速：1.0ml/min 样品：注射用头孢哌酮钠,对照品,样品,1.头孢哌酮降解物B2.头孢哌酮3.头孢哌酮S异构体,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱
17、：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367）柱温：40 流速：1.0ml/min（杂质A+光照）,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367）柱温：40 流速：1.0ml/min（样品）,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18
18、4.6250mm 5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367）柱温：40 流速：1.0ml/min（中间体+样品）,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um，波长：267nm流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367）柱温：40 流速：1.0ml/min（样品光照）,色谱应用实例（多糖）,色谱柱：凝胶柱（水相），流动相：水 检测器：RID柱温：25 流速：1.0ml/min,
19、1,2,3,4,Mn1：19340002：1085003：69304：550,有机碳,0,5,10,15,C14,C6,C7,C8,C10,C11,C12,C5,C13,C9,柱子:5 m,Dimensions C18,4.6 x 150 mm,流动相:A CH3CN,B-H2O流速：1.0 mL/min 0min 30%70%柱温：30 C 15min 80%20%检测器：ELS Detector 20min 80%20%,色谱应用实例（维生素）,色谱柱：硅胶键合 NH2柱，150*4.6mm，波长：210nm流动相：100mM硫酸钠（pH2.1）+1.2mM辛烷磺酸钠：乙腈=90：10流速：1.0ml/min 样品：水溶性维生素,1.D-抗坏血酸苯甲酸2烟酸3.烟酰胺4.泛酸5.L吡哆醛6.维生素B67.吡哆胺8.硫胺素(维生素B1),有机酸,1,1,3,2,4,5,6,7,8,9,色谱柱:Acclaim Mixed-Mode WAX-1,5 m4.6x150 mm流动相:25 mM磷酸二氢钠,pH6柱温:30 C流速:1.0 mL/min检测波长:210 nm1.奎尼酸2.莽草酸3.乙醇酸4.乳酸5.醋酸6.甲酸7.抗坏血酸(维生素C)8.异抗坏血酸9.丙酸,Thank You!,
