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1、第四章 目的基因的分离和克隆,第一节 目的基因的获得第二节 获得目的基因方法的选择第三节 目的基因重组体的构建,第一节 目的基因的获得,一、化学合成二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因三、建立基因组DNA文库四、构建cDNA文库筛选目的基因五、其他方法,一、化学合成法 自动化 DNA合成仪,1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对 应的多肽链氨基酸序列 2）较短的DNA片段，有专一性和定向性2.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载 体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3、5-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物,再用同样的步骤
2、与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。,应用范围：1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因,二、建立基因组DNA文库,基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体。1.特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5端控制基因转录的调控序列,内含子的分布和作用,以及重复序列的数量分布及大小,2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程）分离纯化基因
3、组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA 制备全部基因组的DNA片断机械断裂 法用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoR,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。,DNA片断与载体的连接包装常用载体：粘性质粒 噬菌体 酵母人工染色体基因组DNA+粘性质粒重组DNA转化细菌 菌落 基因组DNA+噬菌体 重组DNA包装成噬菌体感染细菌 噬菌斑1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。,基因组文库大小的计算1975年L.C
4、larke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：In（1P）N=In（1f）P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99）；f为插入的限制片断长度整个基因组DNA总长度。例如：从人基因组DNA（总长度为3109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99，那么这个基因组文库要多大？In（10.99）N=9.2106 In（11.51033109）,若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9
5、105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5105左右,均可满足建库要求。,表4-1 三种常用基因组文库克隆载体的比较,四、构建cDNA文库,cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（gene library）。,特点：cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同不能研究基因组的结构功能,构建cDNA文
6、库1.制备mRNA 1)取材：mRNA约占总RNA的15，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2)从总的RNA中分离mRNA将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸 oligo(dT)纤维素中进行亲和层析,2.第一股 cDNA合成 1）以Oligo(dT)为引物：从模板3末端开始，沿模板的35方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA2）随机引物：以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成,自身引导法
7、：置换合成法 外加引物合成法 4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞(如图4-5),筛选目的基因 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为探针将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）,免疫结合法 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125 I
8、 标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。,获得目的基因的其他方法,构建差示文库筛选特殊基因 差示文库（differential library）又称扣除文库（subtracted library）,是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。mRNA差异显示法获得目的基因 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为DD-PCR法其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。基因改造可获得新型目的基因 采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使表达
9、产物量提高或降低毒性，有助于研究基因间的相互作用（如协同抑制效应）。,第二节 获得目的基因方法的选择,一、根据获得目的基因的研究目的选择方法 为了研究基因全长结构、调控、DNA信息分析 构建基因组文库，为了开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建cDNA文库。若目的基因序列明确可设计引物通过PCR/RT-PCR克隆。若目的基因序列短小可化学合成。二、根据目的基因本身特点选择方法 对从基因组中克隆的基因(内含子)只能真核表达 对从cDNA中克隆的基因(无内含子)可在原核/真核表达 要选择mRNA表达丰富的组织材料，PCR克隆的基因必须测序。三、根据实验室设备条件选择方法 构建文库无需自行构建，有商
10、品出售。目的基因序列明确，也无需建库，可直接用PCR/RT-PCR克隆。,第三节目的基因重组体的构建,一、质粒DNA的分离纯化二、目的基因与载体的连接,二、目的基因与载体的连接,粘性末端的连接 1.单酶切点的粘性末端 全同源性粘性末端 高背景 双向插入,不能定向（如前图2-5，2-6）2.双酶切片段的定向克隆粘粘 非同源互补的粘性末端 重组方案中最有效简捷的途径。粘平,平端连接法 1.同聚物加尾法 2.用衔接物连接法 3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）EcoRI粘性末端：5AGCGGCCGCG 3 TCGCCGGCGCTTAA5BamHI PasI粘性末端：5GATCCGG.CACT
11、GCA3 3 GCC.GTG 5 BamHI PasI 4.TA克隆法 TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3端加上两个游离的“A”。,目的基因,目的基因：特定功能的基因与相应载体重组后能在宿主细胞中表达的DNA。相对宿主细胞称外源基因。,化学合成法,用脱氧单核苷酸按特定的已知序列以3-5磷酸二酯键的形成（采用缩合反应），逐个进行延伸达所需长度后，去除保护剂，再分离纯化，即可获得目的基因。,二、聚合酶链反应,1.原理：以DNA变性复制的某些特性为原理，以目的DNA片段为模板,利用酶促反应（Taq酶），在特定引物的引导下，将加入的4种dNTP由引物沿模板从53
12、按碱基配对原则,形成与模板DNA互补的半保留复制链,新合成的链又可作为下一轮循环的模板。经25-30个循环产物呈 2n指数扩增，由pgg（紫外可见），可获得基因片段。（如图）目的DNA片段:染色体DNA RT-PCR：cDNA,2.应用：1）诊断 带有异常外源基因（如病毒）变异基因（肿瘤、遗传病等）2）合成特异基因或目的基因3）合成特异探针,3.特点：反复循环便于获得大量的基因拷贝Taq酶作用下每一轮PCR循环会产生103104的错配率,所以多用于基因检测，如果用于基因重组表达，在此之前必须进行DNA序列分析。,原核生物：基因组小，限制性核酸内切酶切成若干片段后，用带有标记的核酸探针进行杂交筛选，人或哺乳类动物细胞：基因组庞大，采用DNA重组技术把某种生物细胞的所有基因分区组装到载体（质粒或噬菌体）上，并随载体导入宿主细胞中进行克隆培养和保存这种克隆群体，这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞（大肠杆菌）中的各种重组DNA分子的集合体叫做DNA文库,简称文库（Library）。,
