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1、医学免疫学与免疫学技术实验,贵阳医学院免疫学教研室,人血清IgG的提取及鉴定,2014-04-22,人血清IgG的提取及鉴定,离子交换层析法提取人IgG血清IgG鉴定,人血清IgG的提取及鉴定,离子交换层析法提取人IgG流程：DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清）装柱、平衡 上样和洗脱 DEAE-纤维素再生人血清IgG鉴定：洗脱液抗原性鉴定琼脂双扩散 纯度鉴定免疫电泳 回收率的测定分光光度法 IgG回收量的测定-直接ELISA,离子交换层析的基本原理,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography,IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离
2、子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。,离子交换层析的基本过程,带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。,离子交换剂,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。纤维素OCH2COO-Na 基质 电荷基团 反离子,阴离子交换剂,二乙氨乙基纤维素，弱碱性,DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。,人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理,人IgG特性:血清含量：9.5-12.5 mg/ml；血清中的IgG属于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白（pI:4-5）。DEAE-纤维素提取Ig
3、G原理：在pH7.27.4的环境中，酸性蛋白被DEAE-纤维素吸附，IgG不被吸附而最早从柱中流出，而得以纯化。,实验步骤,1、DEAE-纤维素预处理：强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强酸处理 0.5N HCl 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）PH7.4 0.01M PB液浸泡抽滤、浸泡2、装柱、平衡固定层析柱 装 柱：柱高度、无分层、无气泡3、样本（人血清）准备 抽静脉血分离血清透析（PH7.4 0.01M PB液 4度过夜）4、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用）,实验步骤,5、上样、洗脱、收集洗脱液 上样
4、流速3ml/10min（记录上样总体积，保留部分血清）洗脱 流速30-40ml/cm2/h 收集 5ml/管（20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测）6、DEAE-纤维素再生 2M NaCl 洗脱其他血清蛋白 拆柱、浸泡 PH7.4 0.01M PB液,洗脱液抗原性鉴定,双向琼脂扩散实验原理：可溶性Ag和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。相应的Ag和Ab相遇后，在比例合适时可形成白色沉淀线。,7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）,实验步骤,抗体,抗原,IgG回收率的测定,分光光度法 蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收
5、峰的光密度值与其 浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。,实验步骤,9、合并含IgG的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。10、通过分光光度法对浓缩后的IgG进行回收率的测定。,回收率=,提取 IgG（mg）12（mg/ml）上样血清体积,OD280 1.43 回收体积12（mg/ml）上样血清体积,回收IgG纯度鉴定,免疫电泳原理：（immune electrophoresis）先将抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，将样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干区带；然后分离的各抗原成分与电泳方向平行槽中含相应抗体的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩散。各区带蛋白在相应位置与抗体形成弧形沉淀线。根
6、据沉淀弧的位置、数量和形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。,实验步骤,人血清,提纯物,兔抗人血清,双扩散,电泳,+,-,19,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG,20,酶联免疫吸附试验原理,利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。,21,直接ELISA 间接ELISA 双抗体夹心法,包被(未知抗原）,加入酶标抗体,洗板,加底物,加终止液,包被(已知抗原）,加
7、入待检标本（未知抗体）,加入酶标第二抗体抗抗体,洗板,加底物,加终止液,包被(已知抗体）,加入待检标本（未知抗原）,加入酶标抗体,洗板,加底物,加终止液,原理示意图,23,人血清IgG抗体的检测 直接ELISA法,测定原理：将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人IgG抗体。当标本中存在IgG时，该抗体与包被IgG结合，最后形成IgG-酶标羊抗人IgG抗体复合物，加入底物产生显色反应。,24,包被：用包被缓冲液将纯化抗体稀释至0、2、4、6、8、10mg/L。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释液，4过夜。,加酶标抗体：每孔加入稀释至工作浓度的酶标抗体100l，37孵育1h。,洗涤：用洗涤液洗涤3次，每次3min，甩净，拍干。,洗涤：手工洗板，弃液拍干，重复5次,加底物显色：每孔加底物液50l，置37孵育15min。,终止反应：每孔加入50l的2M H2SO4，混匀,【步骤】,封闭：每孔加入封闭液0.1ml，4孵育1h。,
