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1、细胞培养液的配制,培养基的选择 依据:经验、文献、尝试 常用:RPMI1640、DMEM 培养基的来源 市售干粉培养基-自己配制 液体培养基-直接使用(注意有效期),培养基的除菌方法 过滤除菌:(1)正压过滤-效率高(2)负压过滤-效率低 高压蒸气灭菌:不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加 配制时加:碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等,RPMI1640培养液配制过程,准备物品(1)不锈钢过滤器,滤膜(0.45m,0.22m),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶(2)培养粉,1N HCl,NaHCO3,青霉
2、素,链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水 消毒物品 滤器中放置0.45m和0.22m滤膜,包装,高压蒸气消毒,配制步骤,(1)10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中,磁力搅拌20min(2)加2g NaHCO3/L,继续搅拌10min(3)加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)(4)加1N HCl约3mL,调pH至7.2,继续搅拌,(5)按要求加血清（血清一般需经56，30min灭活）例如:10%胎牛血清 无血清培养液 900ml 灭活胎牛血清 100ml(6)正压过滤除菌(气压适当,防止滤膜破裂)(7)分装,贮存
3、于4，2周内用完。(8)无菌试验:取样,37放置2472h,无细菌、霉菌污染方可使用,注意事项,谷氨酰胺在溶液中很不稳定，分解，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制母液（200 mmol/L,即29.22g/L）,每100ml加入0.52 ml母液，终浓度14 mmol/L 抗生素在37稳定性维持34d,可控制轻度污染。防污染重在无菌操作,培养液配制过程（以RPMI1640为例）,1.物品准备,(1）滤器、微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。,(2)培养粉、NaHCO3、1N HCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水,2.滤器消毒准备,取孔径为0.45m和0.
4、22m滤膜各一张，浸入三蒸水中,将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上,将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒,3.液体配制,将培养粉倒入容器中,加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌,按照实验的具体要求分别加入 NaHCO3和青链霉素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水,取0.5ml；链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水,取0.5ml),按要求加入一定比例的血清（血清一般需经56，30min灭活）例如:配制含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1升，应加入 无血清培养液900ml 灭活胎牛血清100ml,加入1N HCl约3mL,调整pH至7.27.4,磁力搅拌器充分搅拌准备过滤,无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。(一般使用氧气。注意气压适当,防止滤膜破裂，),将液体倒入无菌滤器，接通气体,过滤后的液体分装于贮液瓶,分装过程严格无菌操作,分装后的液体贮存于4，2周内用完。,谢谢！,
