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1、细胞骨架的观察,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,1.实验目的,熟悉免疫化学方法的原理及操作步骤。掌握掌握考马斯亮蓝R250染色法及观察细胞内微丝的方法。掌握用间接免疫荧光法显示细胞内微管的方法。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,2.实验原理,2.1 免疫组织化学技术 2.2 细胞骨架的观察,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,2.1 免疫组织化学技术,免疫组织化学(Immunochistochemistry)是利用免疫学抗原抗体反应的原理，用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织细胞内特定抗原进行定性、定位和定量研究的一项新
2、技术，又称免疫细胞化学(immunocytochemistry)。免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等优点，又能够同形态、功能及代谢等研究结合起来，用以研究其它技术（如化学、生化、免疫及生理等）难以深入的领域。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,免疫组织化学的过程,（1）抗原的提取与纯化；（2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体 的纯化；（3）将显色剂与抗体结合形成标记抗体；（4）标本的制备；（5）免疫细胞化学反应以及呈色反应；（6）观察结果。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,免疫荧光法,免疫荧光法分为直接法和间接法。直接法：将荧光素（最常用异
3、硫氰酸荧光素、FITC）标记在特异性抗体上，使其直接与细胞上相应抗原结合，在荧光显微镜下观察即可鉴定未知抗原。间接法：将荧光素标记在第二抗体上，待一抗与细胞抗原结合后，再用标记了的二抗与一抗相接，从而显示未知抗原。间接免疫荧光法中具有2对抗原、抗体系统。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,2.2 细胞骨架的观察,细胞骨架(cytoskeleton)是真核细胞细胞质中错综复杂的蛋白质纤维网络，按纤维直径、组成成分和组装结构的不同分为微丝(microfilaments，MF，57nm)、微管(microtubule，MF，2025nm)和中等纤维(
4、intermediate filaments，IF，811nm)。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标、组织化学等。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,微丝的观察考马斯亮蓝法,考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。实验中用1Triton X100可抽提掉胞质中除骨架蛋白以外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,微
5、丝的观察荧光法,用荧光染料甲基罗丹明标记的鬼笔环肽处理后，可在荧光显微镜下看到微丝动态变化的图象。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,微管的观察免疫组织化学法,用抗管蛋白的免疫血清(一级抗体，例如兔抗管蛋白抗体)与体外培养细胞一起温育，该抗体将与胞质中的微管(抗原)特异结合，然后再加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二级抗体），例如异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体共同温育，该二级抗体与一级抗体结合，从而使微管间接地标上荧光素。置荧光显微镜下用一定波长激发光照射即由荧光所在显示出微管的形态和分布。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,2.实验材料、用品,实验材料：培养的Hela细
6、胞实验用品：实验器材：光学显微镜，荧光显微镜，冰箱(20及4)，小型振荡器，温箱，细胞培养设备；平皿，直径30mm小染缸，载玻片，盖玻片，铝盒等。主要试剂 M缓冲液，1%Triton X100（用M缓冲液配制），0.2%考马斯亮蓝R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制），3.7%甲醛PEMD，甲基罗丹明鬼笔环肽染液。PEM缓冲液，PEMP缓冲液，PEMD缓冲液，兔抗管蛋白血清（一抗），FITC-羊抗兔抗体（二抗），甘油-PBS(9:1，pH 8.5-9.0)。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.实验步骤,微丝的观察考马斯亮蓝法细胞培养在平皿中的盖玻片上，生长密
7、度达+时，取出盖玻片，用PBS洗3次。用1%Triton X100处理2530 min，室温或37均可。立即用M缓冲液轻轻洗细胞3次。略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5-15 min。PBS洗数次，滤纸吸干。用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min-1h。然后小心用水冲洗，蒸馏水冲洗，空气中略干燥。普通光学显微镜下用40物镜或油镜观察。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.实验步骤,细胞培养在平皿中的盖玻片小条上，当细胞生长密度达+(约70%80%)时取出放进小染缸中，用PBS清清冲洗。3.7%甲醛PEMD室温固定10 min，用PBS洗去固定液后，略干燥再放人预冷的20丙酮中再固定
8、35 min，取出略干燥。在清洁的载玻片上滴加20l染液，将盖玻片上的细胞样品反扣其上，放人湿盒内，置暗处室温下染色2025 min。然后用PBS洗3次，无离子水洗2次，略干燥后甘油PBS封片。荧光显微镜下观察结果，用绿光激发。,微丝的观察甲基罗丹明鬼笔环肽法,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.实验步骤,细胞培养在盖玻片上，长到+时取出，用37预温的PEMP缓冲液轻轻漂洗细胞。0.5Triton X-100/PEMP溶液预温到37，处理细胞152min。用PEMP缓冲液洗细胞2次。用3.7%甲醛PEMD溶液室温下固定细胞30 min，PBS洗两次，用滤纸吸干多余的液体。抗管蛋白抗体
9、用0.3%Triton X-100/PBS稀释成1:4、1:8、1:16等不同浓度，分别滴加约40L在细胞上，将此长满细胞的盖玻片反扣在清洁的载玻片上，放在铺有湿纱布的铝盒内，密闭，37温育1 h。,微管的观察,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,取出样品，放35mm小染色缸内，按下列顺序洗涤，以除去残余的抗血清：PBS1%Triton X100/PBSPBS。每次洗5min，可以放在小型振荡器上轻轻振荡洗涤。然后取出样品，用滤纸吸去水分，略干燥。在细胞面上滴加40 L左右FITC-羊抗兔抗体(用前仍以0.3%Triton X100/PBS稀释成1:4或1:8)。同步骤5放37温育1 h
10、。同步骤6洗涤细胞，无离子水洗样品二次。略干燥后，用甘油-PBS(9:1)封片。置荧光显微镜下观察，蓝光激发，外加阻断滤片K530。先用低倍镜观察，后转油镜观察。,微管的观察,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,考马斯亮蓝显示细胞微丝,5.实验结果,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,FITC标记的细胞微管（400）,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,甲基罗丹明鬼笔环肽标记的细胞微丝（1000）,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,6.注意事项,各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。用1%Triton X100 抽提杂蛋白要作预实验，抽提时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干
11、扰大。甲基罗丹明鬼笔环肽标记微丝，染色时间勿太长，否则背景发红。在没有固定液3.7%甲醛PEMD的情况下，也可以用-20冷甲醇代替，但是效果较差。细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多，形态挺直。反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显得稀少。每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,7.思考题,微丝观察实验中，1%Triton X100 处理细胞的作用是什么?此实验是否能看到微管、中间纤维?为什么?M-缓冲液的作用是什么?如果使用的抗体浓度越高，温育时间越长，是否免疫荧光图像会更清晰?试分别用细胞松弛素B（3g/ml培养液）、秋水仙酰胺（0.05g/mL培养液）在37下处理培养的细胞2h，然后按前述实验方法作考马斯蓝染色，细胞内纤维形态有什么变化?比较所得结果并解释之。,
