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1、基因工程及其医学应用 Genetic Recombination and Genetic Engineering,概论,基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。,重组DNA技术发展史,pSC101,EcoRI,Boyer 和Cohen的实验,Boyer 和Cohen的实验,pR6-5,大肠杆菌,pSC101,pR6-5,抗四环素,抗卡那霉素,EcoRI,抗卡那霉素基因,DNA连接酶,重组DNA分子,培养平皿,大肠杆菌,第一节 基因工程概念,克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。,（一）DNA克隆,分子克隆,细胞克隆,动物克隆,DNA克隆 应用酶学方法，在体外将某些遗传物质的
2、DNA与载体DNA结合，形成一种具有自我复制能力的DNA分子，转化至宿主细胞中，进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。,DNA克隆,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取DNA分子,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,（二）基因工程,SS基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,SS,按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。,基因工程产品,第 二 节自然界的基
3、因重组 DNA Recombination,一、接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,可接合质粒如 F 因子(F factor),质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,二、转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,三、转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因
4、重组即为转导作用(transduction)。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway),例,目 录,目 录,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,（一）同源重组,四、基因重组,（二）位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,例 噬菌体DNA的整合噬菌体的整合酶识别
5、噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。,（三）转座重组,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。,第 三 节 基因工程的核心技术,一、重要的技术工具,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双
6、链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,B
7、st,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,（二）基因载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制；具有两个以上的遗
8、传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,1.质粒(plasmid),特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,目 录,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2.噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,3.粘性质粒(cosmid),酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterial
9、artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,（一）核酸探针与分子杂交,二、常用技术的原理和用途,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,复性,RNA,DNA,探针技术,探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷
10、酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,DNA印迹技术(Southern blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,RNA印迹技术(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析。,蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,其他斑点印迹(dot blotting)原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵(DNA array)DNA芯片技术(DNA chip),三种印迹技术的比较,DNA点阵,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,（二）聚 合 酶 链 反
11、 应,模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本组成成分,PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,1 目的基因的克隆2 基因的体外突变3 DNA和RNA的微量分析4 DNA序列测定5 基因突变分析,PCR的主要用途,三、重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,（一）目的基因的获取,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain re
12、action,PCR)（见第22章）,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形
13、成的平端,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,（五）重组体的筛选 1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补
14、救(marker rescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,原位杂交,Southern印迹,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难
15、表达大量可溶性蛋白,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞,第四节基因工程在医学中的应用,（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,（二）生物制药,重组DNA医药产品,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗(germ line gene therapy),1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,
