《5核酸RNA.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《5核酸RNA.ppt（78页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、RNA,核酸的化学2,RNA的一级结构,RNA的基本组成单位是AMP、GMP、CMP及UMP。一般也含有某些稀有碱基核苷酸。彼此通过3,5-磷酸二酯键连接而成多核苷酸链。尽管RNA分子中核糖环C2上有一羟基，但并不形成2,5-磷酸二酯键。,RNA的高级结构,RNA主要是单链结构，但局部区域可卷曲成双螺旋结构，或称发夹结构(hairpin structure)。双链部位的碱基一般也彼此形成氢键而相互配对，即A-U,G-C。双链区有些不参加配对的碱基往往被排斥在双链外，形成环状突起。,RNA的种类,mRNA：messenger RNA 信使RNAtRNA：transfer RNA 转运RNArRN
2、A：ribosomal RNA 核糖体RNA,细胞核中的RNA（真核生物）：核不均一RNA(HnRNA):mRNA前体 核小RNA(SnRNA):参与RNA的加工,mRNA(messenger RNA),它是蛋白质生物合成的模板。含量少，约占RNA总量的3%5%，代谢活跃，更新迅速，半衰期较短。mRNA的功能是把核内DNA的碱基顺序按照碱基互补的原则，抄录并转送至胞质，指导蛋白质的合成。,真核mRNA特点,原核mRNA特点,真核生物成熟mRNA特点,1、5端帽子结构（cap sequence):m7GPPPN帽子结构能促进核蛋白体与mRNA的结合,加速翻译起始速度,同时可以增强mRNA的稳定性
3、。3末端多聚A的尾巴：可能与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定有关。,5端帽子结构（cap sequence),m7G5ppp5N7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5,5-磷酸键。帽子结构能促进核蛋白体与mRNA的结合加速翻译起始速度，同时可以增强mRNA的稳定性。原核生物无此结构,大多数真核细胞mRNA在3-末端有一段长约20200个多聚腺苷酸的polyA尾。polyA是在转录后经polyA聚合酶的作用而添加上去的。原核生物无此结构polyA的功能：1、与mRNA从细胞核转移到细胞质有关；2、与mRNA的半衰期有关，新合成的mRNA，polyA链较长，而衰老的mRN
4、A，polyA链缩短。,3末端多聚A,2、真核生物mRNA是单顺反子的，而原核生物的mRNA是多顺反子的。多顺反子：原核生物mRNA可编码几条不同的多肽链。单顺反子：只编码一条多肽链。,mRNA转录和翻译,3、真核生物成熟mRNA的与原核生物的区别：真核生物：转录和翻译是分开进行的原核生物：转录和翻译耦合,真核生物：先在核内转录生成前体mRNA，核不均一RNA（heterogeneou nuclear RNA，hnRNA）（在细胞核内合成的mRNA的初级产物）经过剪接成为成熟的mRNA,mRNA的成熟过程,1、mRNA5端无帽子结构,3 端一般无多聚A的尾巴。一般没有修饰碱基。2、多顺反子（p
5、olycistron）:一分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息，可以作为几种蛋白质的模板，能翻译出几种蛋白质。3、转录和翻译,原核生物mRNA特点,tRNA：转运氨基酸,tRNA(transfer RNA)是细胞中一类最小的RNA，约占细胞中RNA总量的15%。在蛋白质生物合成中起携带氨基酸的作用，它的名称也由此而来。但它的生理功能不仅仅是转运氨基酸，它在蛋白质生物合成的起始作用中，在DNA逆转录合成及其它代谢调节中也起重要作用。,tRNA的二级结构,每种氨基酸都有26种相应的tRNA，书写时在右上角注上氨基酸缩写符号，如tRNAPhe代表转运苯丙氨酸的tRNA。tRNA由7090个核苷酸组成
6、，二级结构呈三叶草形(clover leaf)。双螺旋区构成了叶柄，突环(loop)区好像是三叶草的三片小叶。由于双螺旋结构所占比例甚高，tRNA的二级结构十分稳定。三叶草形结构由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TC环等五部分组成。,tRNA的三叶草型二级结构,1,2,4,loop,anticodon,反密码子,载运氨基酸,臂,稀有碱基,RNA中的碱基配对原则 A-U G-C,3,extra,DHU,次黄嘌呤,不同的tRNA具有不同的额外环，所以额外环是tRNA分类的重要指标,TC,tRNA的三级结构,tRNA的三级结构，形状象一个倒写L字母,rRNA(ribosomal RNA),
7、占细胞中全部RNA的80%，是蛋白质生物合成的场所，存在于核蛋白体内；核蛋白体(ribosome)又称为核糖体或核糖核蛋白体。它是细胞内蛋白质生物合成的场所；rRNA是构成核蛋白体的骨架，原核生物核蛋白体中蛋白质约占1/3，rRNA约占2/3，真核生物中则各占一半；核蛋白体有两个亚基组成，一个称为大亚基，另一个称为小亚基，两个亚基都含有rRNA和蛋白质，但其种类和数量却不相同。,rRNA,原核生物和真核生物核蛋白体亚基比较,rRNA二级结构,rRNA的分子结构基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列而成。,16S rRNA二级结构,大肠杆菌5SrRNA,RNA的功能,核酸的理化性质,核酸的紫外
8、吸收碱基含有共轭双键最大吸收峰260nm左右,OD260的应用,DNA或RNA的定量判断核酸样品的纯度判断DNA是否变性,核酸的变性,DNA变性：某些因素作用下，双链间氢键断裂，双螺旋结构解开，形成无规则线团状分子的过程。本质：双链间氢键和碱基堆积力的破坏降解：核苷酸骨架上3，5-磷酸二酯键断裂,增色效应,完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA 2540%、RNA 约1.1%实质：碱基暴露,由于变性引起紫外吸收增加的现象增色效应,缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到 0.1 分）可根据各点的OD260值绘制成DNA的熔解曲线。,Tm,Tm值大小与下列因素有关,GC含量经验公式：G+C%
9、（Tm69.3）2.44介质中的离子强度（P131）,复性,变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的DNA单链重新缔合成为双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing),减色效应,复性时紫外吸收减少的现象,核酸分子杂交,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成
10、。这种现象称为核酸分子杂交。,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,分子杂交的应用,Southern 印迹法Northern 印迹Western 印迹法原位杂交生物芯片,Southern bloting,是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。,Northern bloting,检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性,核酸原位杂交,特点1、能在成分复杂的组织中进行
11、单一细胞的研究2、不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高,Western bloting,western blot实验步骤、显影（视频）,生物芯片,试样处理,点阵固定,反应或杂交,芯片制作,标记,洗涤,检测扫描,光刻合成微量点样喷墨,纯化、标记,光化学检测电化学检测,计算处理,小 RNA,干扰小RNA（siRNA）,微小RNA（miRNA）,小RNA,人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2。其它98的基因组有什么功能呢？,信使RNA,转运RNA,核糖体RNA,人类基因组绝大部分被转录成RNA，非编码RNA的数量是编码RNA的数百倍。生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，
12、而非编码序列内。,小RNA,后基因组时代的中心法则,RNA 加工,DNA 修复和重组,基因组的保持,基因组的调节,后基因组时代的基因调控：小RNA 调控,小RNA,22个单位长度左右的具有基因调控作用的小分子RNA,RNA干扰现象,1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫的研究中，用反义RNA阻断par-1基因的表达。意外的发现，用正义RNA作为对照时，正义RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。,RNA干扰现象,干扰小RNA（siRNA）,A:control:not stainedB:wtC:wt+antisense RNAD:wt+ds RNA,RNAi,与靶基因序列同源的双链RN
13、A所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象.,Andrew Z.FireCraig C.Mello,siRNA与RNAi,Dicer,小干扰RNA Small Interfering RNA，siRNA,RNAi的原理,RISC,RNA-Induced Silencing Complex,RNAi的原理,RNAi的原理,第一个被发现的miRNA(lin-4)由哈佛大学的Victor Ambros 发现的（1993）第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后Frank Slack(Ruvkun 实验室）发现的（2000),Victor Ambros,Gary Ruvkun,微小RNA
14、(microRNA,miRNA)的发现,miRNA,miRNA是一种小的，类似于siRNA，含1925个单核苷酸的单链RNA分子。真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA。,miRNA,Dicer,小的双链miRNA,miRNA的作用机制,RISC,阻断基因翻译,miRNA与疾病关系的研究策略,哪些miRNA表达,miRNA文库筛选,分离,克隆,测序,miRNA表达谱分析,哪些基因是miRNA的靶基因,哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动,miRNA在什么时候、在哪里表达,功能分析,治疗,诊断,siRNA和miRNA的相同点,小RNA世界,核酸的分离纯化,1 防止核酸的生物降解细胞
15、内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,2 细胞的破碎3 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。,酚/氯仿抽提酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。,4 核酸的沉淀乙醇沉淀,核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。,：摩尔吸光系
16、数A：吸收值W：每升溶液磷重量L：比色杯内径,病毒和核蛋白,有机体内核酸常与蛋白质结合成复合体称为核蛋白体。,病毒染色体,病毒病毒是由具有侵染性的核酸和蛋白质组成的。病毒是介于生物和非生物之间。病毒能使动物和植物发生多种疾病；病毒还能侵染细菌，侵染细菌的病毒称为噬菌体。病毒的核酸可以是DNA或是RNA，但是在目前已知的病毒中未发现同时含DNA和RNA的。在病毒中核酸位于病毒粒子的中心，外面包围着蛋白质，形成 衣壳病毒的侵染性是由核酸引起的，衣壳无侵染性。,烟草花叶病毒,噬菌体,噬菌体T4结构示意图,头部,颈部,尾鞘,尾丝,基板,H（1-15）,N（1-9）,核小体的结构,染色体染色质（chromatin）特指真核细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体。,
