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1、,第八章 PCR技术及其用,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,94,55,37,PCR仪,PCR仪,1.PCR技术的原理,PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，在体外由酶催化合成特异性DNA片断。这种方法以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板一侧的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异DNA片断。,第一节 PCR技术原理和工作方式,2.PCR的扩增步骤,模板DNA变性,引物DNA复性,引物DNA延伸,Denature tem
2、plate DNA by heat(95 oC),Target Sequence,Target Sequence,模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCR Cycle-Step 1,PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(Tm)and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,
3、3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle-Step 3-At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNAPolymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以
4、dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,Target Amplification,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,5 cycle=32 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,PCR的反应程序P137
5、,（1）第一步 预变性（denaturation）,90-96oC下几十秒至几分钟，模板DNA双链完全变性成单链,（2）第三步 复性（annealing）,40-65 oC下1分钟，引物优先与模板复性。,引物的浓度高 引物的链短,（2）第二步 变性（循环）,90-96oC下几十秒,90-96 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。,（4）第五步 变性（denaturation）,70-75 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。,（3）第四步 延伸（extension）,（5）第六步 重复（repeat）,第二步第三步第四步,复性,延伸,变性,95oC 5
6、min,50oC 1min,72oC 2min,94oC 1min,温度循环,PCR,1.Buffer,3.PCR反应体系,任何一个生物化学反应都在一定的缓冲体系中进行，提供pH缓冲能力和有助于反应进行的成分,Tris.HclMg 2+Mn2+扩增特异性和产率,PCR反应体系,2.dNTPs,dNTPs:dATP dTTP dGTP dCTP,扩增产量、特异性和保真度,3.Primer,PCR反应体系,引物是PCR过程中引导互补链DNA合成的一种脱氧核苷酸寡聚体,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。,位置,TCAG ATCC,AGTC TAGG,53,35,AGTC
7、,ATCC,引物的长度,一般引物设计为长1630bp引物长，特异性高 引物短，有效性高,有效性:反映PCR扩增产中产物是否积累特异性：引物和模板之间错配的频率,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCTATCGAT3,3GATAGCTACTTAAGACG5,3端必须与模板正确配对，5端可以不配对,3末端碱基最好为G或C,template,primer,尽可能提高G+C含量（40%-60%），以提高引物与模板的结合力,引物的碱基组成,4种碱基随机分布，避免连续相同碱基排列或内
8、部回文序列.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,3）避免形成引物二聚体（dimer）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,Upstream primer vs Downstream primer,Sense primer vs Antisense primer,Primer1 vs Primer2,Forward primer vs Reverse primer,4）引物中的核苷酸序列与非靶DNA的核苷酸
9、序列以及靶DNA中引物互补序列以外的核苷酸序列之间的相似性不得超过70%，并且不能有连续8个以上相同的核苷酸序列。,3 5,5 3,5 3-OH,HO-3 5,5 3-OH,HO-3 5,引物的Tm值,Tm=（G+C)4+(A+T)2,当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于Tm值5 oC。,手工计算：,一般估计：,引物的浓度,一般使用终浓度各0.5-1mol/L,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼
10、此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。,引物设计现在多用专业软件,套嵌引物（nested primers),1,3,2,4,如Primer5.0，Oligo6.0等,4.Template,PCR反应体系,但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。,模板的量：,一般PCR104-107个,纯度：,PCR对模板DNA的纯度要求不高,5.DNA polymerase,PCR反应体系,第一类酶:具有5-3方向的DNA合成（聚合）性能，没有3-5方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及
11、其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，它不能纠正合成过程中出现的突变。,自从H.A.Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC)，PCR技术才进入实用阶段。,Taq DNA聚合酶,热稳定性,Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。,最适温度：75-80 oC 延伸速度：约35-150nt/s.酶分子最长延伸长度：6.7kb,最适温度高,Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过600bp长度的DNA就有
12、可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是Mg2+）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。,Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。,第二类酶:和第一类酶类似，它有合成特性，没有3-5方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。,无3 5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。(RT-PCR、反转录),Tth DNA聚合酶,第三类酶：具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们
13、具有3-5方向的外切酶活性。,VENT DNA聚合酶,有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。,Pfu DNA Polymerase,Taq Plus DNA Polymerase,有3-5的外切酶活性，5-3外切酶活性。,但PCR产物为平端！,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。,是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。,Taq的PCR产物3端往往带有一个A。,5.PCR反应液的配制,一般,template,dNTPs,Taq,buffer,ddH2O,primer,template,dNTPs,ddH2O,primer,Taq,buffer,ddH2O
14、,特殊,A+B,Mg,Mg,template,dNTPs,Taq,buffer,ddH2O,primer,热启动,Mg,蜡珠,dNTPs,buffer,ddH2O,primer,Mg,加热冷却,需要的模板量极低。,6.PCR的特点,（1）特异性强,PCR使用专门合成的DNA引物。延伸过程是在高温下进行。,（2）敏感性高,这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！平台效应！,RT-PCR：(reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR),对模板的
15、纯度要求低。,（5）可以扩增mRNA,（4）简便,先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。,（3）快速,整个PCR过程约4小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,第二节 PCR产物的克隆,一 在PCR产物两端添加限制性酶切位点,在设计克隆方法时,主要考虑产物如何能与克隆载体高效连接,5ATGCAGAAACTGATCGATCTATCGAT3,3GATAGCTACTTAAGACG5,template,primer,设计特定的引物通过扩增来实验添加,无须在产物的两端连接带酶切位点的接头,在选择酶切位点的种类时,要保证所选的
16、酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在.,酶切位点,保护碱基,二 A-T 克隆法,pCR系列载体,Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。,结构,pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。,MCS的中部已经切开，各有一个3端突出的T。,特点,Taq酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3末端加上一个突出的A。,pCR2.1,pCR2.1的MCS,克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。,pCR2.1-topo,pCR1000,Promega 公司的T载体系列,pGEM-T vector,T vector的克隆过程简便！,A,A,T,T,T vecto
17、r,PCR product,T4 DNA ligase,A,A,三 平末端DNA克隆,用具有35外切酶活性的DNA聚合酶（如vent DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶等）扩增出来的产物，其末端为平末端。,连接体系中除加有T4 DNA连接酶外，还加有限制酶Srf，连接过程中载体自连的产物总是被Srf切开，而重组载体确不能被切开，转化子中重组子的比例就较高。,1、pCR-Script Amp SK(+)克隆载体,载体的lacZ基因下游融合了一个致死基因ccdB，载体自连转化的大肠杆菌不能存活，重组载体的转化子则能长成菌落，因为致死基因已被插入失活。,2、pCR-Blunt克隆载体：,四、长片段D
18、NA的PCR扩增,1.降低PCR效率的因素,高温降低缓冲液缓冲能力,从而损害模板DNA和 PCR产物 高温下二价阳离子促进DNA裂解 长片段变性较困难 聚合酶与模板的趋近和结合困难错配限制产物的长度,一是改进PCR缓冲液体系。二是采用混合酶，主体使用扩增效率高的酶,少量使用具有3-5外切酶活性的酶,2.改善策略,扩增两个引物外侧的未知序列,一 反向PCR P143,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,template,template,3,5,5,3,第三节 PCR扩增未知DNA片段,
19、使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。,反向PCR,T,反向PCR,二 利用接头的PCR,利用接头的PCR一般是将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物。根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可以将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。,三 热不对称交错PCR（TAIL-PCR）,TAIL-PCR是一种利用随机引物进行染色体步查的技术。原理：设计较长的高退火温度的嵌套特异引物和较短的低退火温度的随机简并引物，通过控制退火温度来控制何种引物占优势，从而控制产物的扩增，使最终扩增产物中目的片段占绝对优势。,Tail-PCR技术路线
20、,Tail-PCR的各级反应,Tail-PCR的技术难点：,Tail-PCR不需要Southern blot就可以扩增并回收插入位点的侧翼序列,极大的简化基因克隆手续。但存在下列技术难点：反应步骤复杂，各个循环条件的设计是比较麻烦；简并引物因物种而异，需要预备试验；由于多级反应，容易因污染而失真。,第四节 与反转录相关的PCR,扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。,Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖,技术关键：,利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。,RNA template,3,5,下游引物,cDNA first strand,3,5,上游
21、引物,cDNA first strand,cDNA second strand,3,5,3,5,反转录酶,Taq酶,PCR,Reverse transcription(RT),下游引物,上游引物,Taq酶,7/5/2023,西南大学生物技术专业 基因工程,68,一、cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE),用于克隆全长cDNA的5和3末端序列。,5 RACE,7/5/2023,西南大学生物技术专业 基因工程,69,3 RACE,mRNA differential display RT-PCR,（1）3端的锚定引物,Oligo(dT)引物
22、的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,VN,TTTTTTTT,V：A、G or CN:A、G、T or C,5,3,二 差异显示PCR,（2）12种锚定引物,AG,TTTTTTTT,5,3,CG,TTTTTTTT,5,3,GG,TTTTTTTT,5,3,TG,TTTTTTTT,5,3,AA,TTTTTTTT,5,3,CA,TTTTTTTT,5,3,GA,TTTTTTTT,5,3,TA,TTTTTTTT,5,3,AC,TTTTTTTT,5,3,CC,TTTTTTTT,5,3,GC,TTTTTTTT,5,3,TC,TTTTTTTT,5,3,
23、（3）5端的随机引物,10 mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,VN,TTTTTTTT,5,3,扩增cDNA第一链。,RT,VN,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二链，并PCR,（4）随机引物与锚定引物成对扩增,12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。,引物组合：,240组在能分出20000多条带！,实验结果：,如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。,在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。,（5）随机-
24、锚定引物PCR的产物电泳比较,不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。,选择有差异的带，进一步PCR作探针。,筛选文库，找到差别基因的全长序列。,细胞A,细胞B,RNA,RNA,用12个下游引物合成cDNA,每一个cDNA组的下游引物与24个上游引物中的每一个引物结合进行PCR扩增,电泳分离,片段分离与扩增,克隆,测序,分析和鉴定,第五节 PCR产生DNA指纹,什么是DNA指纹？指具有完全个体特异的DNA多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。可用来进行个人识别、亲权鉴定及骨髓移植后监测。,在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR
25、产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,一、多重PCR(multiplex PCR)：,西南大学生物技术专业 基因工程,在高等真核生物庞大基因组背景下，引物长度缩短到一定程度以后，单一引物就可以扩增出多个PCR产物。RAPD引物一般为10-11nt。,二、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD),西南大学生物技术专业 基因工程,79,高等真核生物基因组DNA酶切，连接接头，然后进行选择性PCR扩增。,三、扩增片段长度多态性(amplified fragment polymorphism,AFLP)：,Realtime PC
26、R（或TaqMan PCR）,荧光实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。,第六节 实时荧光定量PCR,常规 PCR Process,In theory,product accumulation is proportional to 2n,where n is the number of amplification cycle repeats,Amplification is exponential,but the exponen
27、tial increase is limited:-A linear increase follows exponential-Eventually plateaus,实时荧光定量PCR的定量方式,荧光检测PCR仪,在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准
28、曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,荧光标记方式,1、SYBR荧光染料,The intercalation dye begins adding at the Extension step.When the proper wavelength is applied,the fluorescence of bound dyes is very high over background.Sybr Green=497 nm,2、TaqMan探针,TaqMan探针是一段5端标记报告荧光基团(R),3端标记淬灭荧光基团(Q)的寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。,当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭基团接近而被淬灭。,但在进行延伸反应时，聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。荧光基团便可发出荧光。,荧光强度与PCR产物量呈正比关系,3发夹型杂交探针,
