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1、第二章 遗传图谱第一节 遗传标记概述,遗传作图的标记,Set the flags on the genomes,一、遗传图谱与物理图谱,遗传图谱与物理图谱遗传作图(genetic mapping)：采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩（cM），每单位厘摩定义为1交换率。物理作图（Physical mapping）：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种作图的计算单位为厘镭（cR），限制性片段作图与克隆作图的图距为碱基对，即DNA的长度。,遗传图
2、谱(genetic map),遗传图谱(genetic map)又称遗传连锁图谱或连锁图谱(linkage map)。经典遗传 学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分析或不同性状个体间杂交为基础，根据同源染色体上 等位基因的变化，通过计算重组率，确定染色体上基因座位的顺序和距离，构建基因的连锁图谱。,经典遗传图谱,人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个基 因组。基因组内每条染色体上的连锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染 色体上基因座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标 记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。人类遗传图
3、谱包括女性一种配子的23条染色体(记作23，X)和男性两种配子的23条染色体(23，X)、(23，Y)上的所有基因位点。,现代遗传图谱,70年代发展起来的DNA重组技术、80年代发展起来的分子标记技术为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标，大大提高图谱的 精确度、准确性。遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。现代遗传图谱的概念是由Botstein D等(1980)首先提出的，在此基础上，限制性片段长 度多态性RFLP作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世。遗传图谱的第二代标记位点是大
4、量的可变数量串联重复（VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR 或SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷 酸多态性(SNP)。,1、形态标记,遗传学上稳定、可见的外部特征遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。,二、遗传标记的 种类,2、细胞学标记,染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。
5、特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。,*黑麦(Secale cereale,2n=14)染色体Giemsa C-带,*常规染色技术与显带技术的结果,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,荧光标记探针检测精子,3、生化标记贮藏蛋白、同工酶和等位酶,种子的贮藏蛋白：同工酶：等位酶：优点：经济、方便、成本较低。缺点：结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。,同工酶与等位酶,同工酶(isozyme)：由一个以上基因座位编码的酶的不同形式。催化同一种化学反应，但其蛋白质本身的分子结构组成有所不同的一组酶
6、。等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型。电泳可区分同一种酶（系统）的不同变化。,材料的采集,研磨和酶的提取,酶的保存,淀粉凝胶制备,电泳,凝胶切片,酶的组织化学染色,酶谱的记录与分析,数据分析,同工酶和等位酶分析的程序,夏腊梅,夏腊梅同工酶谱照片,4、分子标记,广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳，
7、即现在通常所说的分子标记都是特指DNA标记。它能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,分子标记的特点,本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1）以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。（2）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造。（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组。（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁。（5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。,遗传标记（genetic marker）具有多型性易于鉴别与目标基因
8、紧密连锁,性状标记 色泽，形态 细胞学标记 倒位，易位，G/N/C带 生化标记 同功酶 分子标记 RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP,基础-基因表达结果表现型,DNA碱基序列变异,三、分子标记的种类,第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括：限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism,简称RFLP标记）；DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）；原位杂交（in situ hybridization）等。,第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,简称PCR反应）为核心
9、的分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA,简称RAPD标记）；简单序列重复标记（Simple sequence repeat,简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism,简称SSLP标记）；扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism,简称AFLP标记）；序标位（Sequence tagged sites,简称STS标记）；序列特征化扩增区域（Sequence charactered ampli
10、fied region,简称SCAR标记）等。,第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism,简称SNP标记）；表达序列标签（Expressed sequences tags,简称EST标记）等。,DNA分子标记的主要类型,依其所用的分子生物学技术大致可以分为：一类是以Southern杂交技术为核心的分子标记，（如RFLP），这类分子标记被称为第一代分子标记。一类是以PCR技术为核心的分子标记，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，这类分子标记被称为第二代分子标记。单核苷酸多态性（SNP）标记等被称为第三代分子标记。它也是以以
11、PCR技术为基础的分子标记技术。,第二节 限制性片段长度多态性标记技术,该技术由Grodzicker等于1974年创立。1980年由 Botstein再次提出。1983年Soller和Beckman最先应用于品种鉴别和品系的纯度的测定。自从人的RFLP图谱构建后，已经分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。,一、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)标记技术的原理,特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分
12、离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。即：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。,EcoR酶切示意图,A sample:5 AG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CG 3 3 TC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-G AATTC-G AATTC-CG TC-CTTA
13、A G-CTTAA G-CTTAA G-GCB simple:5 AG-GAATTC-GAATCC-GAATTC-CG 3 3 TC-CTTAAG-CTTAGG-CTTAAG-GC 5 AG-G AATTC-GAATCC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAGG-CTTAA G-CG,A,B,A,B,限制性内切酶位点,与放射性探针结合部位,限制性内切酶酶切后；电泳分离DNA片段；转移至硝酸纤维素薄膜；与放射性探针杂交，分析阳性条带,RFLP的原理,DNA限制性内切酶酶切 电泳转移到硝酸纤维素滤膜 同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小,二、R
14、FLP标记技术的操作步骤,DNA提取：酶切：3-5 ug DNA，以20 U内切酶酶切6小时至过夜。电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶30-60 V电泳6小时至过夜。染色观察：,DNA提取酶切电泳印迹,下列图谱哪个是合适的酶切结果？,变性：脱嘌呤：0.25 mol/L中脱嘌呤，10 min。变性：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl，45 min。水冼；中和：1 mol/Ltris-HCl(pH7.5)，1.5 mol/L NaCl，30min。印迹：用10 SSC，进行Southern 印迹冲洗：以2SSC 冼胶，风干,杂交洗脱,预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5 HSB
15、、Denhardt）中，封好后置65温箱中振荡56小时。杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65温箱中振荡过夜。洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65 振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。,放射自显影数据分析,将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室中将 X-光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-80超低温冰箱中曝光过夜至10天左右。使用磷屏仪，操作更方便。用计算机处理得到的数据信息,RFLP探针的来源,来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。gDNA探针:检测的
16、多态性频率较高，但不同种属特异性较强。如：水稻RFLP探针可以在下列网页获取：玉米RFLP探针可以在下列网页获取：,标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 放射性同位素标记：灵敏度高，成本低 但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰期限制 非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）：安全，标记稳定，探针寿命较长 但灵敏度较低，背景较高，成本高,32P、35S和3H,RFLP探针的类 型,（1）随机引物法（2）切口平移法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法,RFLP探针的标记方法,探针标记随机引物法,25 ng变性DNA 5 uL 寡聚核
17、苷酸2 uL BSA3 uL-32P dCTP 2 uL Klenow酶加水至50 uL，37中标记反应2 h。,RFLP标记技术所用的仪器设备,杂交箱 紫外交联仪 同位素检测仪 水浴及摇床 电泳及转膜装置,三、RFLP标记特点,优点：共显性，可以区别纯合和杂合基因型。稳定、重复性强。某些植物中开发探针已遍及整个基因组。缺点：DNA需要量较大，技术复杂。用于做图较费时，难以分析大量样品。在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。,第三节 RAPD和AP-PCR标记技术,主题一、RAPD标记技术,一、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)的原理,RAPD(Random Ampl
18、ified Polymorphism DNA)：Williams(Du Pont)等于1990年创立。Williams J G K et al,Nucl Acids Res,1990(18):6531 其基本原理基于PCR技术：RAPD标记技术就是用一个随机引物（10个碱基左右）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。,二、PCR技术-回顾：PCR(Polymerase
19、Chain Reaction)技术：Three steps:denaturation,primer annealing,polymerization.Peoples Choice Reaction,The PCR cycle,95oC step to denature the duplex DNA,An annealing step of around 55C to allow the primers to bind,72oC polymerization step.Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer a
20、nd enzyme,PCR procedures,Template(DNA/cDNA),primers,Taq enzyme,10PCR buffer,with Mg2+,dNTPs,pre-denaturation-denature completelyDenaturationannealingElongationcycles:25-30,PCR reaction components and their functions template：ssDNA,dsDNA mRNA needed to be RT as cDNAsamples：from blood,sperm or any oth
21、er tissue,from older forensic specimens,from ancient biological samples or in the lab.From bacterial colonies or phage plaques.DNA：very stable,primersIf the PCR product is to be cloned,it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5-ends of the primers.Can ampl
22、ify fragments over 10kb in lengthStore:纯化引物在25乙腈溶液中4；冻干引物于-20可保存1-2年，液体状态于-20可保存6个月。不用时应-20保存。,Primer designMost important!(1)length:2030bp(2)G+C contents:ATCG random distributed(3)primers:no complementary sequence(4)3end of the primer:no modification(5)5end of the primer:product length，can be modif
23、ied(6)specificity:less than 70%homology with non-specific amplification sequence,or 8bpcontinuous complementary base,Primer designed with the help of computerDNA databaseconservative region comparision,blast Primer designed software,buffer：10-50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20)。1.5-2.5 mmol/L Mg2+：for
24、Taq polymerase activity Low conc.:low activity high conc.:non-specific amplification dNTPs：贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200 umol/L，分装-20保存。4种dNTP浓度应相同。,Taq DNA polymerase：from thermophilic bacteria.Taq polymerase from Thermus aquaticus.other thermostable DNA polymerase with gre
25、ater accuracy used for certain applications.,Taq DNA聚合酶特性：,分离:1969年，美国黄石国家公园温泉。分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L忠实性:没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般出错率为210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。,抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在
26、使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20至少6个月。,Taq DNA聚合酶特性：,Selection for DNA polymeraseKlenow酶早期采用该酶不耐热，缺点有:温度要求低(37)，受热即失活；产物特异性不高；积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）,thermostable DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom T.thermophilusVENT DNA polymerasefrom T.litoralisSa
27、c polymerasepfu polymerase,mineral oil,PCR optimization变性温度和时间92-95，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、1-2分钟。延伸温度和时间温度：72，接近Taq酶的最适75时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加,PCR技术发展速度惊人，没有一种技术能与之相比。PCR技术是目前引用论文最多的技术，应用范围十分广泛。PCR
28、技术1993年度诺贝尔化学奖（Mullis），与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获。,三、RAPD技术与常规PCR不同的地方：引物长度短：常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。退火温度低：RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37。扩增结果可以是1至多条带。,RAPD标记与常规PCR扩增的结果,四、RAPD标记技术的操作,PCR反应：DNA（20 ng/L）1 L Primer(10 pmol/L)2 uL 10Buffer2.0 L Mg2+（15 mmol/L）2.0
29、 L Taq酶（5 U/L）0.15 L dNTP（25 mmol/L）0.2 L加水至20L(再加入石腊油)，进行PCR扩增,Step1 94 5 minStep2 94 60 secStep3 36 60 secStep4 72 90 secStep5 GO TO Step2-4 35-40 cyclesStep6 72 5 minStored in below 4 freezer,PCR扩增程序：,五、RAPD标记技术的特点,（1）不需DNA探针，设计引物不需先知道基因组的任何分子信息，无须知道序列信息。引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有广泛性和通用性。（2
30、）所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体DNA研究中也可使用；（3）显性遗传（极少数共显性），一般不能鉴别杂合子和纯合子。（4）实验步骤少，技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。（5）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低。（6）缺点：大多显性遗传，一般不能鉴别杂合子和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。,省、快,六、RAPD标记技术转变为SCAR 标记技术,1、SCAR 标记技术的原理：序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region,简称SCAR标记）：SCAR标记是在RAPD技术
31、基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。2、SCAR 标记技术的特点：SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。,3、SCAR 标记技术的操作步骤：RAPD扩增回收特异RAPD片段PCR产物的克隆获得SCAR标记,七、RAPD标记实例：,实例一：亲本中国春小麦、节节麦双倍体和子代的RAPD电泳图谱 引物为S516:CTC
32、TGCGCGT 泳道1为中国春小麦，泳道2、二者的子代，泳道3为节节麦。,实例二：RAPD扩增克隆鱼(B)、供体红鲤(A)、受体金鱼(D)和杂交鱼(C，即AxD)的细胞核DNA指纹图谱。结果显示，对于不同的引物，克隆鱼的扩增谱带均和供体红鲤的一致，迥异于受体金鱼和杂交鱼。,实例三：水稻苯达松敏感致死基因的RAPD标记和SCAR标记(本课题组的部分工作),1、苯达松对植物的作用苯达松为一种选择性、输导型除草剂，其作用靶标是光合系统，抑制植物光合作用电子传递。,抗性植物对苯达松的解毒过程研究,2、水稻苯达松敏感致死基因的发现两种水稻苯达松敏感致死突变体：苯达松（Bentazon）为一种苯并噻二唑类
33、除草剂，普通水稻品种具有对苯达松的抗性。1984年，日本 Mori k，农林8号 60Co-射线 农林8号m 1999年，中国张集文等，W6154S 60Co-射线 8077S(M8077S)Mori K、陈忠明等、张集文等通过遗传学分析表明：两种不同来源的苯达松敏感致死基因均为核控制的隐性单基因。,3、克隆该基因的意义,利用杂种优势是大幅度提高农作物产量的重要途径。雄性不育是杂种优势利用的基础，但在杂交水稻制种和生产过程中，存在两大障碍：1、雄性不育系易受环境温度的影响而出现育性不稳定。2、杂交稻制种需将不育系（母本）和恢复系（父本）分行种植，授粉靠人工赶粉，程序繁杂、劳动强度大。,水稻苯达
34、松敏感致死性状作为一种化学致死标记，由单个隐性核基因控制，因此，它在杂交稻生产中具有广阔的应用前景。其利用价值表现在：1、转育不育系，保证杂交水稻种子纯度。2、转育恢复系，革新杂交水稻制种方法。,4、RAPD 分 析,使用美国Operon公司编号为A、B、C、D、E、F、G、H、I、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z系列引物，进行RAPD分析，有344个引物能扩增出110余条不等肉眼可辨的谱带，有11个引物未能扩增出任何条带，有5个引物扩增结果弥散（smear）。最终有5个引物OPT15、OPF03、OPG18、OPE09、OPD10在农林8号和农林8号m之间扩增出7个多态性标记，分别记作OP
35、T15/1100、OPF03/1700、OPF03/1198、OPG18/943、OPG18/972、OPE09/1900、OPD10/1248，这7个多态性标记经3次重复结果稳定一致。,RAPD markers between Norin8 and Norin 8 m(Polymorphic fragments noticed with arrows M-DNA+EcoR I+Hind DNA marker),OPT15/1100、OPF03/1700、OPF03/1198、OPG18/943为农林8号m所特有的谱带，OPG18/972、OPE09/1900、OPD10/1248为农林 8
36、号所特有的谱带，其中引物OPG18在农林8号和农林8号m之间分别扩增出多态性标记OPG18/972和OPG18/943，OPF03在农林 8 号 m 中扩增出 2 个多态性标记OPF03/1700和OPF03/1198。,7个RAPD多态性标记经纯化，连接到质粒载体pCRTM2.1，转化大肠杆菌InVF，在LB+Km 50mg/L+X-gal培养基上筛选白色单菌落，提取质粒DNA，经EcoR I内切酶酶切鉴定，由DNA自动序列分析仪测定序列。,5、RAPD多态性标记转换成SCAR标记,The sketch map of pCRTM2.1 vector,Electrophoresis of pl
37、asmid DNA of recombinant digested with EcoR I M-DNA+EcoR I+Hind molecular marker;1,2,3,4,5,6,7plasmid DNAs of OPT15/1100，OPF03/1700，OPF03/1198，OPG18/943，OPG18/972，OPE09/1900 and OPD10/1248 clones cut with EcoR I respectively,OPF03/1198 CCTGATCACCTCCTCCTGTGAGCACAATGATCCACAGTTTTTGAATGCTACCATGCTTCACTAG
38、ATTTGTCTATAAATATATATATCTCACCTTAGTGAAGCAAAACACAAAGCTGATAGGTAACATGTAAAAGCTTTGTACTCATCTAATAGAGTAAATTACATCCACGGTACATCAACTTGGCAGGTAGATGTAATTTGGTGCAATAACTTGAGAAATAATCATTTACAACAACTTAATAGGTATGTGCAATTTAGTATAAGAATTTTATAAGTGATCCTATAAATACAACAACTTGCAAGTTAGGTACGATTTTCATAGAACAAATAAAAAGGTTATGCGGCAACTTAATTATTTGGAGCA
39、TTTTTTATATAAATTCATTTTTAAGTACTTATTTTGACAATATACTATCATGGATTTGTATAAGTATATTTATATTTTTATCCTAATAACTAATAATTAAAAGTCAATTAATCCGGATATAGAAATTATTATATTTTGGTTGATATTTGAGAAGGTGAAGAAAACTAAAAAAGTTCTTAAAGTAAATTAGATGTAAATTGTACTACATAAGTTTTAAAGATTAAATTCAATATTATAAGATAATATCCGTATGATTATTATGTAATGGCATATTGACATCGAGAAAAAAAACTCACCTAG
40、CATATGCTTAGCCTAGTTGATGCACAAAAATACTAAATTGTTAAGTTCTTGTACTAAAACGCACCTACTTGTCAAGTTATTGCACTCGGACGTTTAATTCTCAAGTTCTTGCACTATATCGCACCAATCTGCCAAGTTGTTATACCATGGGTGCAATTTACTCACAATAATATAACAACTTTTAGCATTCAGGATTTATCCTAAAACATGACAACTTCTCTACCAACATTCTCTTCCCAACTTCACTAAAAAAATTCTCTTTCCAACCAGTCACAACCTTCCACCATTCACTTTTTCCAC
41、CGTCATCTACTTTTTAACCAATCACAGCATCTTCCAATTTAATTCCACCTACTTTTTTAATAACCATATCCAACTGTAAAACTTCTTATATTCTGTGGCAGAGGTAGTAGCAATTTGCACACCTTTCACAAGTGTACATACGCAACCATCAACCTTTTGGTTCAGCATCCCTAGCCCTTGCAATCACCCTAGGCCTCCTCTTCTTGGTTACTGTCAATGGTTGTGGTGATCAGG,OPD10/1248 GGTCTACACCTTATTATTGCACACTATTCAAATTTAGTTTTGGACTGTGATTCT
42、GTTTAGCATAAGTTTTGCATAGGACTTGTAAAGGTCATTTAAGTTCTGGTCCTTGTTTTCACACGGAATTTATGGAGCTAGGATTGTCGACGTTTGATGTCTCGACTACGGTATTTGGACAGTATGGGGATCGTCGGTGCTAGGATATACGCGAGACTAAGGTAAAAGAGATGGAGATAGGGATTTTTATACAGGTTCGGGCCCCTAAGTGGTCAAGTAATAACCCTACATCCTGTTGGCCGGAGCCGGAGTTGCTTTTATTCACCATAATCACACCAGTACAATATGTGGGTAGCCTAT
43、CTAACTGTTGTCGACATGGCGGTCTGAAGGTCTGACTCGTAGTCGACAACAGGGTAGCCTTCCTCCTCGAATCCGTGTCCGGCGAGATCAGAGATAGCGCTTTCGTATCTCCCGACAGTATCCGGAGACACCGTAGGGGAATAGCCATGCCTATCCCTGAAGTCGATATCCGGCGGCGTGTCTTGGCGTATGTAGGCTTGTATGTTGTGGCTTCTGGTGGGTGTATGTTGATTCTCCCTGGTGGGTGTCCTGTGTCCCCTCTCCTCCTAGGGGGGCTTGTATTTATACCCATAGGTTGTC
44、CCCTTGTCCAAGTAGAACTAGGGAAACCAATATGGATACAATCCGAGTAGTCCTTGTCGTTTCCATGTAGAACTCTGGTTGTCTTTACTTATCCGGAACTCCCTCGAGGTCAGTTTCCGTATAAGACATGGTATGTGGTGGATCCTGCCAAGGTTTAGTCAACTACTATTAGGGATGTGGTATGCATAACCATGACAGTGGCCCCCGACTTCAATGCAAATGAACGAGTTCATATTCTCAACCGCAGACTTCGGAGGAACTGTTATTGAGCTCACGTGACCGTTCTTGGTGAGTTTAGAG
45、ATAACGTTAGACTTCCTTTGTCAGCCTCGTGCGGGCACCGAAAGGGTTTGTCAAAGTCAATCTCTGATGTCAACCAAGGAAGTACATAGCGTACGACTAAGTCTCCCGTCTTGCCGTAATCGAGAATTTGGATTGAAGTCAAGAAATTCTATCTCGGCGGGTACACCATTTCTTCATTCCGTATTCCTTGTCGAGATCCAGCAACCGTTCTCGAGCGTTCGAGAAGGCGTAAAGTCTGCGACGGAGCCTTGTCGACATTTGTCGTACTCGCCTTAGTCGATCTTGGTGTAGACC,OPG18
46、/972 和 OPG18/943,Sequences of primers for each SCAR locus derived from RAPD markers,SCAR markers between Norin8 and Norin 8mM DNA+EcoR I+Hind molecular marker,获得了5个SCAR标记：SCAR/G18/890、SCAR/G18/883、SCAR/G18/919/948、SCAR/D10/1237、SCAR/F03/1186，,主题二、任意引物PCR(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，
47、APPCR)标记技术,创立：Welsh和McClilland等，1990年。Welsh J et al,Nucl Acids Res,1990,(18):7213 引物：引物较长(1050 bp)；长度不定，常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物，T3和T7启动子通用引物）。浓度较高 PCR反应分为两个阶段：首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。,结果分析：通常采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳或高分辨率的琼脂糖胶分析PC
48、R产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的APPC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同。,特点：APPCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。APPCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。,主题三、DNA扩增指纹印迹(DNA amplification fingerprinting,DAF)标记技术：,创立：Caetano-Anolles等，1990年
49、。与RAPD不同的是:引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比RAPDs大得多。,小 结：,RAPD、AP-PCR和DAF共同优点：在不需要知道所扩增DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。RAPD、AP-PCR和DAF共同缺点：对反应条件非常敏感，重复性差。,第四节 SSR标记技术和ISSR标记技术,主题一、简单序列重复标记（Simple sequence repeat,SSR),Satellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。Min
50、in Satellite DNA:15-70 bpMicrosatellite DNA：一类由几个核苷酸（一般1-6个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。继RFLP之后的第二代分子标记。多态性好、重复好、共显性标记 SSR（Simple sequence Repeat）=microsatellite=STR(Short Tandem Repeat,）,一、引 言,Variable Number of Tandem Repeat(VNTR),minisatellite,15-70 bp,microsatellites,2-6 bp,二、SSR标记技术的原理,SSR即微卫星DNA(Micr
