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1、DNA抽取和质粒DNA制备,提取DNA总的原则,1 保证核酸一级结构的完整性；2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。,核酸分子抽提的技术设计,核酸的释放：破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法）核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液,核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）
2、后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤,鉴定与保存,（一）核酸的鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定,浓度鉴定,1紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,2 荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。,纯度鉴定,1 紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的
3、残留量。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。,2 荧光光度法核酸电泳结果进行评定。,完整性鉴定,凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。,核酸的贮存DNA保存,1 短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。2长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,核酸的贮存RNA保存,RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液
4、中，可在-20 保存。,基因组DNA的分离与纯化,DNA样品准备,常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70或液氮,DNA提取,1 酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。,主要试剂的作用：EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2 降低细胞膜的稳定性,SDS的作用：1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂；2 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来；3 对RNA、DNA酶有抑制作用；4 与蛋白质形成R-O
5、-SO3.R蛋白质复合物，使蛋白质变性。,蛋白酶K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。,酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。,2 甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤
6、甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。,3 玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。,4 异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。5 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,DNA样品的纯化：透析、层析、电泳及选择性沉淀。电泳法简单、快速，是DNA样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。PAGE分辨率高，适用于5-5
7、00bp大小的片段。,琼脂糖含量（W/V）线性DNA分离范围（Kb）0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1 2,DNA的浓缩,1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。,DNA的检测,溴乙锭染色：在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。银染法：Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高
8、200倍，但不能回收。,DNA分析,通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小，如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好，如分子量小或一片糊状，表示DNA有降解。,DNA回收,主要是从电泳中分离回收DNA片段。回收原则：尽量提高回收率 去除回收DNA样品中的污染物,电泳到DEAE-纤维素膜：DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的DNA分子。在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带DNA都到膜上，取出洗下。500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。,透析袋电洗脱：切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内
9、，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。,低熔点琼脂糖凝胶：切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提回收DNA。方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。,琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA,问题,从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖，目的是（）A 抑制核酸酶 B 保护DNA，防止断裂 C 加速蛋白质变性 D 有利于细胞破碎,用SDS-酚抽提DNA时，SDS浓度十分重要，当SDS浓度为0.1%时，
10、（）A 只能将DNA抽提到水相B 只能将RNA抽提到水相C 可将DNA、RNA一起抽提到水相D DNA和RNA都不能进入水相,异戊醇的作用是（）A 使蛋白质脱水B 使DNA进入水相C 帮助DNA进入水相D 减少气泡，促进分相,变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是（）A 氧化物可使DNA磷酸二酯键断裂B 氧化物会改变PH值C 氧化物同DNA形成复合物D氧化物在DNA分离后不易除去,酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间？,酚使蛋白质分子间脱水而变性，变性的蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留在两者之间。,为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？,苯
11、酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。,质粒DNA制备,质粒简介,质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。,由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等等。,质粒是携带外源基因进入细
12、菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术,质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。质粒含有编码某些酶的基因，在一定的环境下对细菌宿主有利。,质粒特性,1.分子相对小 2.含有高效的自主复制成分 3.不相容性4.转移性5.选择的标记6.限制性内切酶单一切口,常用质粒载体,pBR322 pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长为4363bp，由3种野生型质粒成分组成，ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01，复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号，以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一
13、个核苷酸。,pUC系统,l 如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一个多种限制性内切酶单一位点的接头构成，全长2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位点接头的方向正好相反。,表达载体,载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等,四、质粒DNA的提取和纯化,1细菌的培养 l 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。,对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质
14、粒DNA的复制不受影响而大量扩增。,l 所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。,2细菌的收集与裂解,细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。,细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。,3质粒DNA的抽提,质粒DNA的小量制备
15、2-5ml 质粒DNA的大量制备 500ml 碱裂解法 方法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法,（三）质粒DNA提取方法的选择,l 常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满意效果至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒，用煮沸法或SDS法进行质粒DNA的大量分离，只是各个实验室的习惯问题.,l 选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素：1菌株类型2质粒的大小3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制4细菌的培养与收集,（四）碱裂解法原理：,在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。,将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之
16、间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。,通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,（二）煮沸裂解法 利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁，在将裂解液煮沸。原理：加热可使蛋白质和染色体DNA变性，但环状质粒DNA结构紧密而不会解链，温度下降后，质粒DNA又重新恢复超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，回收上清液中质粒DNA,煮沸裂解法比较剧烈，只用于提取小质粒。对于会释放出大量糖类的菌株不适宜。如HB101及衍生菌。,（三）
17、SDS裂解法 比较温和的抽提方法。将细菌悬浮在等渗的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解酚-氯仿抽提。适合于大于15kb的质粒DNA的抽提，但产率不高。,4质粒DNA纯化,l 质粒从细菌中分离出来以后，为满足有些实验的要求还应进一步纯化。CsCl溴乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经典方法。但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来，发展了几种不同的方法取代了超离法。如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质粒DNA。,l转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分
18、析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的DNA样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。,1 CsCl-EB法 超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。,2 聚乙二醇沉淀法 分级沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子RNA，用Rnase酶消化小分子RNA；在利用乙二醇选择性沉淀大质粒DNA，再利用酚-氯仿抽提。方法简单实用，但是不能区分环状或开链质粒DNA,3 柱层析法,以硅基质作为填
19、充层析柱的树脂，在多盐的条件下，DNA与硅基质可逆性的结合进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用50%的乙醇洗去RNA和糖类物质，再加入TE或水，离心洗脱。,RNA的分离与纯化,（一）（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法,以（异）硫氰酸胍和-巯基乙醇为裂解液裂解细胞，PH在4.0的条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤,（二）改良方法：以（异）硫氰酸胍-酚为裂解液，再加入氯仿形成两相，变性的DNA与蛋白质位于两相之间，上层是RNA溶液。最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤,mRNA的分离,（1）oligo(dT)-纤维素层析柱法,（2）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法（3）磁珠分离法,简述溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA的原理？,1氯化铯是一种重金属，在高速离心后信成一定的浓度梯度2溶液中不同的大分子在离心时，根据自身的分子的浮力密度形成不同的致密带，蛋白质密度低位于上层，RNA位于最下层。3EB存在时，由于EB可以插入到DNA双螺旋分子中，使得DNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的质粒DNA，EB不能插入少，故可将不同结构的DNA分子分离。,对于HB101及其衍生物不宜使用煮沸法，其原因是,碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的（）,THANKS,
