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1、,第二十八章 移植免疫及其免疫检测,移植（transplantation）:将健康细胞、组织或器官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以替代或补偿机体所丧失的结构和（或）功能的现代医疗手段。移植物（graft）供 体（donor）受 体（recipient）或宿主（host）,概 述,自体移植根据移植物来源 同系移植 同种异体移植 异种移植 原位移植根据移植部位 异位移植 器官移植移植物种类 支架组织移植 细胞移植,移植的类型,组织器官移植种类和命名,移植名称 供者、受者关系 举例 自体移植 同一个体 自体断肢再植，自体皮片移植 同系或同基因移植 同系或同基因 人的单卵双生子间的器官移植
2、的个体间 同品系小鼠的皮片移植 同种异基因移植 同种不同基因 人与人之间的肾移植 的个体间 不同品系小鼠间的皮片移植 异种移植 异种动物间 狗的器官移植给猩猩 猪的器官移植给狗,第一节 引起排斥反应的靶抗原,1 主要组织相容性抗原人 HLA 鼠 H-2遗传特征：单倍型遗传高度多态性2 次要组织相容性抗原,主要组织相容性抗原（MHC分子）,父 母 HLA是人体多态性最丰富的基因系统。据1999年的统计，HLA复合物等位基因总数已达到1031个，其中HLA-B等位基因有301个,A9Cw3B7,A2Cw2B13,A1Cw1B5,A3Cw4B8,HLA的遗传特征,第二节 排斥反应的种类及发生机制,移
3、植排斥反应（transplantation rejection）,针对移植抗原产生免疫应答，从而导致移植物功能丧失或受者机体损害的过程。,分类：超急性排斥反应 急性排斥反应 慢性排斥反应,机制：受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统,导致血管内凝血。预存抗体来源：1、供受者之间ABO 血型不合；2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植。处理：重新移植预防：ABO血型配型、细胞毒实验,1.超急性排斥反应,2.急性排斥反应,体液性排斥 抗体激活补体，并有CD4+T 细胞参与，导致急性血管炎细胞性排斥 CD8+CTL细胞的细胞毒作用、CD4+T和巨噬细胞的作用，导致急性间
4、质炎。处理 使用免疫抑制剂,在急性排斥反应中的两条抗原提呈途径：直接途径（direct path）:残留于供者移植物内的抗原提呈细胞（过客细胞）对受者机体的免疫系统提供最初的抗原刺激。这种抗原性刺激，来自移植物中树突状细胞和单核细胞等表面富含的HLA-、-类分子 间接途径（indirect path）:通过受者体内的抗原提呈细胞对具有同种异基因HLA-、-类分子的移植物实质细胞的识别。无论是供者还是受者，其抗原提呈细胞提供的IL-1、IL-6等刺激信号，有助于触发淋巴细胞的活化,同种移植排斥反应的发生机制,慢性排斥反应的介导因素：T细胞、巨噬细胞等介导的迟发型超敏反应等免疫损伤。B细胞产生的抗
5、体活化补体或通过ADCC破坏血管内皮细胞。急性排斥反应反复发作所导致的移植物组织退行性变，此与细胞 和体液免疫均有关系。非免疫相关因素，诸如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反应的发生临床特征：对免疫抑制疗法不敏感无特异性治疗方法，最终需要重新进行器官移植,3.慢性排斥反应,定义：在骨髓移植时，供者骨髓中的免疫细胞启动以受者细胞为靶抗原的免疫应答反应，引起攻击受者的移植物抗宿主反应。GVHD也可见于脾、胸腺和小肠移植。发生机制：T细胞起主要作用 IL-2、IL-6、TNF-、IFN-等 ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等,4.移植物抗宿主反应,
6、第三节 HLA分型方法,血清学分型法,应用一系列已知抗HLA的特异性标准分型血清与待测淋巴细胞混合，借助补体的生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。,操作简便易行、节约试剂、结果可靠、重复性好 无需特殊设备,优点,缺点,耗时长不同批号抗血清结果常有不同,用于HLA分型的微量细胞毒试验,血清学分型法,细胞学分型法,以混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture,MLC）或称混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）为基本技术的HLA分型法。能用本法测定的抗原称为LD抗原（lymphocyte defined antigen）,包括HLA-D
7、、-DP。,1.单向MLC,原理：将已知HLA型别的分型细胞用丝裂霉素C或X线照射预处理，使其失去增殖能力仅作为刺激细胞；而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。两者混合培养时，反应细胞可对刺激细胞发生应答而增殖，用3H-TdR掺入法测定细胞增殖强度，从而判断受检细胞的HLA型别。,根据选用的刺激细胞类型分为：,1阴性分型法,2阳性分型法,遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HLA不同，能相互刺激导致对方淋巴细胞增殖，故称双向MLC。在此试验中，各自的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞，反应后形态上呈现的细胞转化和分裂现象，可通过形态法计数转化细胞。,2.双向ML
8、C,分子生物学分型法,限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析：最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术 PCR-RFLP分型法：对DNA片段进行体外扩增，然后再用限制性内切酶进行酶切分析，可使限制性长度分析的敏感度大大增加,1.RFLP与PCR-RFLP分型法,序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-sequence specific oligonucleotide,PCR-SSO）是以PCR为基础，将凝胶上扩增的HLA基因DNA转移至硝酸纤维膜或尼龙膜，进而用放射性核素或酶、地高辛等非放射性物质标记的寡核苷酸
9、探针与之进行杂交，从而对扩增产物作出HLA型别判断。分类：斑点或印渍法：用扩增的待测DNA印渍或点至固相支持物，再与探针行杂交，利于大量标本分型反向斑点或印渍法：将已知DNA印渍或点至固相支持物，然后与扩增的待测DNA（预先标记）杂交，用于少量标本分型 PCR-SSO是类HLA分型应用最广泛的方法，能够鉴定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因,2.PCR-SSO分型法,基因芯片(gene chip)是近年发展起来的一项新技术,将其与PCR-SSO结合应用于HLA分型，可使分型趋于规模化和自动化，尤其在HLA多态性和疾病遗传背景分析等方面更具优势。HLA的基因芯片分型法，实际上是PCR
10、-SSO反向斑点或印渍法的微型化。目前，基因芯片在HLA分型领域的应用尚属起步阶段。,2.PCR-SSO分型法,原理：应用设计的一套HLA等位基因的序列特异性引物（sequence specific primer,SSP）,对待测DNA进行PCR扩增，从而获得HLA型别特异性的扩增产物HLA基因扩增的特异性包括：座位特异性（locus-specific），如HLA-A、B、-DRB1等；组特异性（group-specific），如DRB1-01、DRB1-02等；等位基因特异性（allele-specific），如DRB1*0401、DRB1*0402等。,3.PCR-SSP分型法,单链构象特
11、异性聚合酶链反应（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）是以对待测基因PCR扩增为基础，对扩增的单链DNA（ssDNA）的HLA分型方法。原理：对ssDNA进行无变性剂的聚丙烯酰凝胶电泳时，因其序列的差异可形成不同的空间构象而导致电泳迁移率的差异，如此可分辨出单一碱基的差异和检测出DNA多态性或点突变，有助于新的HLA等位基因或突变体的发现。特点：PCR-SSCP作为PCR-SSO的补充，在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处，有利于排除SSO杂交的假性。,4.PCR-SSCP分型法,基于序列的HLA分型法（sequence
12、-based HLA typing,SBT），通过对扩增后的HLA基因片段通过核酸序列测定来判断HLA型别。基本过程：分离待测细胞的DNA，应用座位、组或等位基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物的纯化和测序，测出的基因序列与HLA基因库的DNA已知序列比较，判断待测的HLA型别。,5.SBT分型法,第四节 常见的组织或器官移植,肾脏移植,肾脏移植，创始于1950年，是临床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。,1.组织配型在肾脏移植中的应用,组织配型是肾脏移植前选择供者的重要手段 ABO血型配型、HLA配型和 交叉配型肾源选择的原则 以ABO血型完全相同者为好，至少能够相容 选择最佳H
13、LA配型的供者器官,2.肾移植受者的疗效检测,疗效监测：受者免疫状态检测临床观测项目:T细胞总数、CD4/CD8比值和IL-2及其受体的检测，判断排斥反 应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果 肾组织活检，预测排斥反应的发生 CsA血药浓度检测，指导合理用药，减少肾毒性,肝脏移植,特点：HLA是否匹配与肝脏移植效果无显著差异机制：肝脏移植时，因HLA不配仅发生较弱的排斥反应，而免疫抑制剂 的应用有效控制了排斥反应的发生肝脏移植时仍应尽可能进行HLA配型,1.组织配型在肝脏移植中的应用,组织病理学特点：肝移植术后第2天，汇管区出现明显的白细胞浸润，汇管区和肝窦的白细胞浸润第7天达高峰，涉及到T细胞、B
14、细胞、巨噬细胞、嗜酸性和中性粒细胞。在浸润的T细胞中CD8+细胞高于CD4+细胞，也见有IL-2R和CD25+的活化T细胞。排斥反应发生几率：约2/3的肝移植患者出现过排斥反应的病理学改变，也有8的病例术后发生急、慢性排斥反应，占肝移植致死原因的10%。,2.肝移植受者的疗效检测,心脏移植与心肺联合移植,ABO血型匹配：避免急性排斥反应的首要条件HLA I、类分子匹配：移植器官长期存活的重要因素。淋巴细胞毒交叉配合和群体反应性抗体检测,1.组织配型在心脏和心肺联合移植中的应用,免疫监测指标：外周血淋巴细胞总数 T、B细胞的转化能力 T细胞亚类百分数及比值 CTL细胞毒作用 细胞因子及其受体表达
15、或转录水平 转化生长因子 NK细胞数及其介导的自然杀伤或ADCC效应 粘附分子及其配体在各类细胞表达情况,2.心脏及心肺联合移植受者的疗效检测,骨髓与其他来源的干细胞移植,特点：可同时发生HVGR和GVHR 分类：自体骨髓移植、同基因骨髓移植 同种异基因骨髓移植（多见）,1.骨髓移植,病例较少成功率高,骨髓移植实际上是造血干细胞移植，因此，骨髓中造血干细胞的质和量对移植的成败致关重要。,2.外周血和脐血干细胞移植,方法：使用药物动员剂促使造血干细胞从骨髓释放到外周血，从中获取足量的干细胞用于移植，可获得与骨髓移植同样的治疗目的特点：与骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血恢复快，
16、GVHR发生率和严重程度不高等优点。移植前检测：HLA和ABO血型配型、血常规与骨髓检验、性染色体测定、造血干细胞鉴定和GVHR征象追踪等,肿瘤干细胞的发现，提示人们在进行干细胞应用时应该注意生物安全性。,适应于同种异型或异基因骨髓移植的疾病包括：再生障碍性贫血、慢性髓样白血病等血液系统疾病，以及脊髓发育不良、严重联合免疫缺陷病、Wiskott-Aldrich综合征、慢性肉芽肿、X-性联高IgM综合征（CD40L缺陷）、骨骼石化症等免疫缺陷性疾病。乳腺、卵巢、睾丸以及肺部等实体瘤，不宜行骨髓移植，多应用自体末稍血干细胞移植治疗，而自体末稍血干细胞移植对再生障碍性贫血、慢性髓样白血病和免疫缺陷病
17、无效。急性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金病等，则既是同种异型或异基因骨髓移植的适应症，也可用自体末稍血干细胞移植进行治疗。,3.适于骨髓或末稍血干细胞移植的常见疾病,第五节 排斥反应的预防与治疗,组织配型,HLA是引起同种异型移植排斥反应的主要抗原供者与受者的HLA等位基因匹配程度决定了移植排斥反应的强弱程度通过HLA组织配型(tissue typing)，选择合适的供者，减轻排斥反应,1.HLA配型,移植物存活与HLA配型的关系是：供、受者HLA-A和HLA-B相配的位点数越多，移植物存活机率越高；供、受者HLA-DR位点相配更重要，因为HLA-DR
18、和DQ基因有很强的连锁不平 衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配；不同地区HLA匹配程度与移植结果的关系有着不同的预测价值，在欧洲HLA 匹配的程度对移植结果的预测性比美国高，因为欧洲人群的近交程度较高，导致HLA位点连锁不平衡性削弱。,交叉配型采用补体依赖的细胞毒试验 阳性对照:阳性对照血清可用淋巴细胞免疫家兔获得 阴性对照:阴性血清可采用无受血史的AB血型男性血清根据反应时参与的细胞成分分类：淋巴细胞交叉配型 T细胞淋巴细胞毒性交叉配型 B细胞淋巴细胞毒性交叉配型 流式细胞法交叉配型 自身交叉配型 结果判度:交叉配型阳性:表明受者预存有抗供体的抗体临床意义:交叉配型阳性:即使组织配型
19、好，也不宜进行移植，易发生超急性排斥反应。在做受体选择时，组织配型差，但交叉配型为阴性，仍可实施移植。交叉配型常用于肾脏移植,2.HLA交叉配型与预存抗体的检测,CML：细胞介导的淋巴细胞溶解试验,群体反应性抗体（panel reactive antibody,PRA）：指用40-60人含已知HLA的T细胞或T、B混合细胞，检测待移植受者血清所得到的抗体阳性百分数。检测意义:用于判断器官移植时受体的敏感程度 高PRA血清:可针对多个HLA抗原发生反应，受体对所接受的移植器 官或组织威胁大注意:应考虑在不同HLA上可能出现的共同表位或称公共抗原（public antigens）与受体血清发生的交
20、叉反应,3.群体反应性抗体的检测,1.移植物的预处理,不同的组织器官的移植，其移植物的处理不尽相同首先是从移植术的角度对离体组织器官进行外科修整，然后根据不同器官的要求采取相应的预处理,移植物与受体的预处理,组织配型或交叉配型移植前应用一定剂量的免疫抑制剂，其用量视组织配型的结果而定术前输血,视患者的需要进行,受体的准备,人工调节受者机体的免疫状态是控制移植术后排斥反应发生的主要途径采取的措施有：使用免疫抑制剂:以此控制受者的免疫应答，降低对移植物的排斥能力 诱导免疫耐受:诱导受者对移植抗原的特异性免疫耐受,免疫抑制措施,参与移植排斥反应的免疫细胞以T细胞为主，T细胞功能抑制分类：,1.免疫抑
21、制剂的应用,1、化学性免疫抑制剂,3、生物性免疫抑制剂,2、某些中草药,环孢菌素A(cyclosporine A，CsA)糖皮质激素，硫唑嘌呤，环磷酰胺，FK506又名他克莫司(tacrolimus)，霉酚酸酯(mycophendate mofetil,MMF),抗淋巴细胞球蛋白(ALG)或抗胸腺细胞球蛋白(ATG),细胞性单克隆抗体，某些融合蛋白,反义寡核苷酸(antisence oligonucleotide),常见免疫抑制剂作用位点,新的研究思路：诱导同种抗原的特异性免疫耐受:通过将同种抗原置入子宫或注射给新生儿而诱导诱导免疫耐受:应用大剂量天然可溶性或人工合成的供者HLA分子，封闭同种
22、抗原特异性T细胞的TCR，以诱导受者特异性T细胞凋亡，产生免疫耐受诱导T细胞无能：使用可溶性CTLA-4以阻断移植物细胞的B7与受者T细胞表面CD28的结合，干扰共刺激信号的形成。CTLA-4与IgFc段的融合蛋白也具有相似的作用阻碍T细胞活化：阻断CD40-CD40L、CD2-LFA3等膜分子的相互作用诱导特异性耐受：借助基因工程技术，制备基因修饰的免疫细胞T细胞疫苗（T cell vaccine,TCV）：诱导抗独特型抗体的产生，破坏针对移植物的特异性T细胞，诱导免疫耐受。,2.对移植抗原特异性免疫耐受诱导,第六节 排斥反应的免疫监测,体液免疫与细胞免疫水平检测的临床意义,特异性抗体水平的
23、检测 相关免疫指标：ABO等血型和HLA抗体 抗供者组织细胞抗体 血管内皮细胞抗体 冷凝集素 测定方法:交叉配型、补体依赖的细胞毒性试验 血清PRA水平:判断器官移植时受体对移植物的敏感程度，基于细胞毒性试验的PRA测定，被作为心脏移植前的常规项目，若PRA超过5，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型，,1.体液免疫水平检测的临床意义,补体水平的检测补体活性与急性移植排斥反应的发生有关当移植物遭受排斥时，补体成分的消耗增加可采用溶血法或比浊法进行检测。补体活性的检测补体的裂解产物，如C3a、C3b、C3d等的测定常用的检测方法有免疫电泳、免疫标记技术,2.细胞免疫水平检测的临床意义,外周血
24、T细胞及其亚类的计数 免疫荧光法或流式细胞仪测定T细胞及其亚群，在急性排斥反应临床症状出现前15天，T细胞总数和CD4/CD8比值升高，巨细胞病毒感染时此比值降低。CD4/CD8比值大于1.20时:预示急性排斥即将发生，CD4/CD8比值小于1.08时:发生感染的可能性很大。若进行动态监测，对急性排斥反应和感染具有鉴别诊断的意义NK细胞活性测定 免疫抑制剂抑制了受者机体杀伤细胞的活性，但在急性排斥时明显升高 混合淋巴细胞反应:刺激细胞:灭活的供者的淋巴细胞 反应细胞:受者淋巴细胞 结果显示的是CTL和NK细胞共同作用的结果。动态监测NK细胞活性则意义更大,血清细胞细胞因子测定 IL-1、IL-
25、2、IL-4、IL-6、IFN-等细胞因子的水平均可升高 个体间血清IL-2R的含量差别显著粘附分子及其配体的检测免疫细胞以及血管内皮细胞等细胞膜表面粘附分子及其配体的表达，与急性排斥反应的发生密切相关。诸如ELAM-1、VCAM、ICAM和HLA分子等,比较受者接受移植物前后的细胞因子水平环孢霉素A具有肾毒性，血清肌酐值增高，而IL-2R却明显降低血清肌酐值和IL-2R同时增高提示急性排斥反应的发生巨细胞病毒感染时，IL-2R血清含量的升高将更为明显,尿微量蛋白检测的临床意义,尿微量蛋白检测意义：判断大器官移植、尤其是肾脏移植时排斥反应的发生 检测免疫抑制药的肝肾毒副作用 1-微球蛋白是能较
26、早反映肾功能损害的指标 尿-1微球蛋白和尿IgG与肾移植受者短期肾功能关系密切尿微量蛋白种类：血浆蛋白：包括白蛋白（Aib）、IgG、IgA、IgM、轻链（）、2-微球蛋白（2M）、补体C3、1微球蛋白（1M）、2巨球蛋白（2M）、转铁蛋白（TRF）、游离血红蛋白（Hb）、肌红蛋白（Mb）及其他血浆蛋白和酶 非血浆蛋白：肾脏的Tamm-Horsfall蛋白（THP）、SIgA、肾小球基底膜（GBM）抗原等,急性时相反应物质检测的临床意义,C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、IL-1、IL-6、TNF以及HSP等炎症分子，是发生炎症反应的标志性分子，在发生感染性疾病和自身免疫性疾病时均有不同程度的增高。受者血清的CRP水平在移植后发生细菌或真菌感染时更为显著。CRP水平与肝、肾移植后并发症的发生相关，且CRP水平似乎比白细胞计数或发烧更能敏感地反映发生并发症的可能,免疫抑制剂体内药物浓度检测的临床意义,免疫抑制药物的主要毒副作用：骨髓抑制，可发生粒细胞减少或缺乏症 肝功能损伤，可表现为肝功能异常，如SGPT或ALT的升高 影响性功能，尤其是男性，少数可导致不育症 脱发 出血性膀肌炎，可出现血尿 恶心、呕吐、食欲不振等消化道表现免疫抑制剂检测意义：通过对血液药物浓度的观察，掌握药代动力学的情况，指导临床用药以充分发挥其防治器官移植排斥反应的同时减少其毒副作用,
