PCR应用问题及对策.ppt

《PCR应用问题及对策.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR应用问题及对策.ppt（150页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、沈 燕,郑州大学第一附属医院检验科,PCR相关技术在临床应用中存在的问题及对策,内 容,一.PCR及相关技术二.PCR技术在临床应用时应具备的条件三.PCR技术在临床应用中存在问题分析四.常见的PCR检测项目及意义,一.PCR及相关技术,PCR原理:实质就是体外DNA复制技术,PCR扩增过程图示,PCR检测的靶目标,临床常用的PCR检测技术,荧光定量PCR 测DNA荧光定量RT-PCR 测RNA,荧光定量PCR技术之一,TaqManTM荧光定量PCR技术,实时荧光定量 PCR,分子信标荧光定量PCR,实时荧光定量PCR技术之二,临床常用的PCR检测技术,荧光定量PCR 测DNA荧光定量RT-P

2、CR 测RNA,PCR相关技术,PCR、定量PCR、DNA测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链分析、变性高效液相色谱（DHPLC）、蛋白截断测验、毛细管电泳（HPCE）、DNA芯片、蛋白芯片、双向凝胶电泳（2-DE）、质谱法,PCR实验室 临床基因扩增检验实验室 分子生物学实验室（分子/基因诊断室）,实验室名称,二.PCR技术在临床应用时应具备的条件,实验室资质-临床基因扩增检验实验室技术验收遵循的法规按照SOP操作,PCR实验室技术准入依据和标准,临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 卫医发200210号临床基因扩增检验实验室工作规范 卫检字20028号临床基因扩增检验实验室现场技术验

3、收表 十章三十八款,临床基因扩增检验实验室技术验收,1.实验室设置和设备 2.设施和环境 3.人员 4.设备管理 5.检测方法 6.标本管理 7.记录 8.报告 9.质量控制 10.抱怨,应遵循的法规,临床基因扩增检验实验室管理暂行办法临床基因扩增检验实验室基本设置标准临床基因扩增检验实验室工作规范,按照SOP操作,写你所做的，做你所写的 重视实践中对SOP的修正,三、在临床应用中存在的问题分析,（一）、防污染措施,（三）、档案管理,（四）、记录,（二）、质量保证措施,（五）、质量审核,（一）、防污染措施,“无基因”概念“基因污染”,“污染”的主要来源,临床标本中存在的大量待测微生物以前分析研

4、究的特定微生物存在于实验环境中的特定微生物以前扩增产物的残留污染。这是PCR实验室最容易产生的造成假阳性的“污染”。科研中得到的质粒克隆,物理的:分区及单向流动、专用移液器、一次性试管架、紫外灯、PCR工作罩、滤芯吸嘴。化学的：dUTP/UNG PCR产物防污染系统、DNA清洁液。方法学的：实时Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RT PCR一步法。制度和操作规范（维护保养、执行）,防污染措施,实验室设施,1、分区：试剂准备区、样品制备区、扩增、分析区2、各区仪器和物品：专用3、单一流动方向：单一方向顺序 人员：试剂准备区 样品制备区 扩增分析区 物品：空气：试剂准备区和样品制备

5、区 扩增分析区,分区,面临的新问题,标本接受和报告发放资料的保存全自动检测体系,固定移液器,易耗品,紫外照射：实验台面、仪器设备、实验室空间 距离 时间,扩增中以脱氧尿苷(dUTP)取代脱氧胸苷(dTTP)，扩增产物可被尿苷酶(UNG)消解，在经加热处理，即在脱氧尿苷处断裂，不再能作为模板被扩增。后续扩增进行之前在PCR反应体系中加入UNG处理，在预变性加热后，可能的产物污染即被消除。,PCR防污染,UNG和dUTP防止“假阳性”的图解这种“假阳性”是由于污染了前次PCR产物所致,T,A,A,A,A,T,T,T,T,A,A,A,A,U,U,U,PCR,A,A,A,T,U,T,A,A,A,U,U

6、,U,A,A,A,A,A,A,*,UNG,加热,PCR,UNG/dUTP 系统,化学方法 10的次氯酸钠（漂白剂）清洗 1mol/L HCl,PCR 方法学/防污染,两步法 RNA cDNA PCR 一步法 RNA PCR,CT(I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman 动力学(Caliper AG-9900 自动加样),Lab on a Chip,封闭废液孔,RT,Taq,Tth(RT+Taq),一次性防护用品的正确使用,一次性手套一次性帽子一次性口罩,监测污染发生的阴性质控的设置,-1份阴性原血清样本-1份在标本核酸提取过程中带入 的空管-仅含扩增反应混合液的管,

7、阴性原血清质控样本的功能,监测实验室的以前扩增产物的污染。由实验操作所致的标本间的交叉污染。扩增反应试剂的污染。,在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能,基本功能与阴性原血清质控样本相同，但不同的是，其基质为水，不含阴性原血清质控样本中可能有的扩增抑制物，因而对污染的反映更为灵敏。不能取代原血清阴性样本。,仅含扩增反应混合液的管的功能,监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或多个空管打开静置于标本制备区3060分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。,（二

8、）、质量保证措施,检测流程,标本采集 核酸提取 基因扩增 产物检测,室内质控,质控目的：假阴性、假阳性，精密度质控点：样本质量、仪器、检测扩增效率/定量质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品控制范围：空白、阴对-阴性 弱阳对-阳性（上下一次方）标准品-r值（二个9）斜率（-3.5-4.0）截距（-40左右）点间CT值（3.3左右）,核酸的分离纯化,靶核酸提取的质量,靶核酸的完整性核酸提取的产率核酸纯度对干扰物的清除,靶核酸提取的质量,靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取的产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定间接法

9、判断血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果,RNA完整性检查,常用变性的琼脂糖电泳法检查，常用的变性剂为甲醛、乙二醛和羟甲基汞。完整的RNA经变性电泳后能分离出核糖体RNA中的28S和18S，且EB的显色强度应为2:1左右。如28S带降低而18S带增加则表示RNA标本有所降解。,靶核酸提取的质量,纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取的产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定间接法判断血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：使用已知病原体

10、含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果,DNA、RNA的浓度和纯度测定及保存,此法准确、快速，且不损坏样品。可测出浓度低于2.5ug/ml的核酸。测定时将样品作适度的稀释。用紫外分光光度仪检测，记录280nm和260nm处的吸光度。280nm为蛋白吸收峰，260nm为核酸吸收峰。其中260nm处读数用来计算样品的核酸浓度。,1、紫外分光光度法,1 0D/A260nm=50ug/ml双链DNA 1 0D/A260nm=33ug/ml单链DNA 1 0D/A260nm=40ug/ml RNADNA总产量（ug）=OD(A260nm)50ug稀释倍数样品总体积D

11、NA浓度（ug/ml）=OD值(A260nm)50稀释倍数提取RNA总产量（ug）=OD值(A260nm)40ug稀释倍数样品总体积RNA浓度（ug/ml）=OD值(A260nm)40稀释倍数,2、琼脂糖凝胶电泳法,未知浓度的微量DNA片段可与已知浓度的DNA同时电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度其含量。电泳时各DNA的体积要准，否则会有误差。,3、纯度检查,天然DNA的吸光度比值为A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515 纯DNA液的A260:A280:应为。如比值低于1.6时，这提示有蛋白质和酚的污染，应进一步纯化。,4、DNA、RNA的保存,4是DNA保存的

12、最佳和最简单的条件之一。-70可能是长期保存的良好温度。但解冻时DNA可产生缺口，因此不宜反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0），4储存6个月以上，其中EDTA还可抑制微生物生长。RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin），终浓度为2U/10l，置-20保存备用。,靶核酸提取的质量,纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取的产率：可在A260读

13、数测定。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定间接法判断血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果，可知提取纯化后是否将有关扩增反应抑制物有效地去除。,核酸样本制备及扩增检测的质控,对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施 核酸提取及扩增有效性的质控,临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质,临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸

14、胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。,对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施,质控措施：采用内质控（internal control,IC）（通常称为内标）的方法 内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。,核酸提取及扩增有效性的质控,已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测有效性的综合反映。,检测仪器,校验周期与内容,频度：首次（新安装）；后续（主要部件维修，强制周期如 每年，不定期）内容：PCR仪：温度准确度及升降速率；荧光本地；激发及吸收波长的准确度、杂闪光、重复性、线性制水机分析仪器,扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法

15、,方法一：直接测定法 是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示 记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1时，其可测出来。,扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法,方法一：直接测定法做法：装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中。然后按程序进行一个常规的PCR扩增。加热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温度。在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。,扩增仪孔间温度的重复性和均一性检测方法,方法二：间接测定法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功

16、能来间接获知孔间的均一性，即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。,带滤塞吸头的使用及质检,方法一：直接观察法 首先制备一个含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸头的最大体积为100l，则将加样器吸取体积调至110120l，再套上吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好，则有色液体不应出现在滤塞之上，否则说明滤塞不严。,直接观察法：,1-2%甘油及甲基橙水溶液,根据枪头体积调整加样枪、吸液,滤塞上出现

17、颜色,不合格,滤塞上无颜色,合 格,带滤塞吸头的使用及质检,方法二：实验监测法 先纯化制备数份强阳性和数份阴性核酸标本然后将加样器吸取量设至扩增加样所需的体积使用待评价带滤塞吸头对一份强阳性样本来回吸取10次（模拟10份阳性样本的吸取），将最后一次的吸取液加至一含扩增反应液的管中。换一个新吸头，连续吸取10份阴性样本分别至10个扩增反应管中。此过程重复35次，最后对每一管按所用试剂方法进行扩增检测。,带滤塞吸头的使用及质检,方法二：实验监测法 合格的表现：强阳性样本应为强阳性，所有阴性 样本应为阴性。不合格的表现：强阳性标本表现为弱阳性或出现 阴性则说明吸头可能含有扩增抑 制物。所有阴性样本应

18、为阴性，出现阳 性则表明吸头不能有效地防止气 溶胶对加样器的污染。,室内质控,质控点：样本质量、仪器、扩增效率/定量质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品控制范围：标准品-r值（二个9）斜率（-3.5-4.0）截距（-40左右）点间CT值（3.3左右）,如何确定CT值,阈值（Threshold）的作用,阈值,CT,阈值高度,标准偏差,阈值=基线信号的标准偏差10,如何确定阈值,基线的作用（Baseline cycles）消除检测中背景荧光信号的影响，确定阈值 基线的范围：仪器一般默认的范围 PE-5700、PE-7000 3-15 iCycle 2-10 LightCycle 3-12 基线需

19、根据实验结果进行适当调整：延长基线以包括最高浓度样本扩增曲线起跳前尽可能多的循环，可以使扩增曲线更平滑、数据也得到一定改善。,阈值线,荧光阈值线的调整 需根据实验结果进行适当调整 1、落在阴性对照线最高点上方 2、外标准扩增曲线的均一位置（点间CT3.3左右）3、尽量接近扩增曲线刚真正进入指数扩增期的位置（避免弱阳性漏检以及一些扩增反应影响因素在指数期的放大）,Threshold Cycle Calculation:Baseline cycles ThroughThreshold Position,2,14,20.8,标准曲线,通过基线和荧光域值线的调整应达到：相关系数（r值）0.99 斜率-

20、3.0-4.0 截距-404（这些参数根据仪器和试剂有所不同）,质控图,室内质控图：统计学质控方法（纠错措施）质控图 室间质评：纠偏措施,常用的质控规则,12s；一个质控结果超过X2S，此为警告规则；12.5s；一个质控结果超过X2.5S，提示存在随机误差；13s；一个质控结果超过X3S，提示存在随机误差；R4s；同批两个结果之差超过4S，即一个质控结果超过X+2S，另一个结果超X-2S。提示存在随机误差；22s；两个连续质控结果同时超过X+2S或X-2S，提示存在系统误差；41s；一个质控品连续的四次测定结果都超过X+1S或X-1S，两个质控品连续两次测定都超过X+1S或X-1S，提示存在系

21、统误差；7T；七个连续的质控结果呈现出向上或向下的趋势，提示存在系统误差；10 x；十个连续的质控结果在平均数的一侧，提示存在系统误差。,在开始进行质控时，只需要有3个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X，s。方法：（1）先将测定值从小到大排列，X1最小，Xn最大；（2）计算X和s；（3）计算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-X）/S 对照SI表，检查是否出控，SI上、下限规定值，在控；SI上或下限规定值，失控。,“即刻性”质控：,SI值表（即刻性质控）N 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N(3s)1.15 1.

22、49 1.75 1.94 2.10 2.22 2.32 2.41 2.48N(2s)1.15 1.46 1.67 1.82 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 2.85 2.88 2.29 2.33 2.37 2.41 2.44 2.47 2.50 2.53 2.56,L-J 结合Westgard多规则质控法,室内质控,质控点：样本质量、仪器、检测扩增效率/定量质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品控制范围：空白、阴对-阴性 弱阳对-阳性 标准品-r值（二个

23、9）斜率（-3.5-4.0）截距（-40左右）点间CT值（3.3左右）,临界值以下标本的处理,依据现有检测体系报告实际检测值使用更敏感的检测体系检测报告单中显示扩增曲线，给临床提示,失控情况处理及原因分析,填写失控报告单上报实验室负责人，由负责人作出是否发报告的决定 分析失控原因,重做同一质控物（人为差错、偶然误差）新开一瓶质控物（质控物使用、保管）新开另一批号质控物（质控物使用、保管）重新校准（校准错误）进行仪器维护，更换试剂（仪器、试剂）请专家帮助,完成失控报告单,（三）、档案管理,仪器档案（a）制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；（b）仪器使用说明书或其复印件；（c）校准/检测的日期

24、和结果以及下次校准和/或检测的日期；（d）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；（e）损坏、故障、改装或修理的历史。人员档案 实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等技术档案。,（四）、记录,内容形式保存,（五）质量审核,型式检查（编号唯一性、项目完整性、书写完整性）仪器检查（状 态、校准）试剂检查（效期）质控检查（室内、室间）异常值检查（及时与临床联系）,四.常见的PCR检测项目及意义,PCR技术的应用领域,感染性疾病的诊断、预后和疗效评估遗传病的基因诊断和产前基因诊断：如血友病、地中海贫血等肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测器官移植供体配型选择药物基因组学

25、、耐药基因的检测与疾病相关的蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测法医学、动植物学、古人类学、古生物学 肌红蛋白小卫星基因，-珠蛋白基因、ApoB基因在基础研究领域中的应用 基因拼接、测序、突变.,临床常见基因诊断项目,在病毒感染性疾病中的意义,1、早期诊断 2、病毒载量与病毒复制 3、病毒载量与治疗 4、基因变异、基因型与药物选择 5、疾病的进展预测 6、生存期预测 7、流行病学,窗口期 指病毒感染后直到检测出相应的病毒标志物前 的时期 影响窗口期的因素 病毒的复制速度 机体的状态 检测方法,1、早期诊断,抗体检测和PCR检测窗口期比较,PCR测定-直接测定病毒,2、病毒载量与病毒

26、复制,病毒严格的细胞寄生性,肝炎病毒：肝细胞HIV：T细胞,病毒复制的快慢决定了血液中的数量多少,血中病毒量与病毒的复制的关系,血中病毒量高 复制活跃血中病毒量低 复制慢,定量PCR分析血液中病毒的量,病毒在靶细胞中的复制情况,3、病毒载量与治疗,例1.病毒载量与治疗.,例2.血浆EBV载量与鼻咽癌复发15个二年持续缓解：0 copy/mL10个复发：32250 copies/mL17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高例3 EBV与淋巴瘤,确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价,艾滋病诊断与治疗指导方案（试行，2002年）,4、药物选择,病毒基因变异检测 病毒基因型检测,HBV拉米夫定耐

27、药性的检测,P基因变异,HBV-DNA聚合酶氨基酸序列 FLLAQYMDD密码子 552组变异 M to V/l FLMAQ YVDD组变异 YIDD,Y=酪氨酸 M=蛋氨酸 D=天冬氨酸 L=亮氨酸 V=颉氨酸 I=异亮氨酸,YMDD变异,P基因变异的意义,YMDD变异与拉米夫啶耐药528位点突变型与乙肝病毒的泛昔洛韦和 拉米夫啶耐药有关。,通过检测528位点基因指导泛昔洛韦和拉米夫啶的合理使用。,检测方法,测序 PCR-RFLP（限制性片断长度多态性）PCR 核酸杂交（谱线探针法）,耐药性检测的应用范围,HBV感染“大三阳”持续治疗八个月仍无效者。经治疗后“大三阳”转为“小三阳”者。经治疗

28、后HBV含量迅速减少甚至呈阴性者。拉咪呋啶或泛昔洛韦持续治疗半年以上者。抗病毒治疗后HBVDNA阴转后又反弹者。,丙型肝炎病毒基因型分析,HCV的基因型/亚型,6个型，68个亚型,1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t5a6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n,基因型与干扰素的反应性,2a、2b、3a型对-干扰素有明显的长期有 效性，而1b型的反应性较差。欧美国家流行毒株多为1a型（或PT型），我 国丙型肝炎流行毒株

29、以1b型(或K1)、2a型(或K2a型)、6a型为主。,HCV基因分型方法,测序型特异性引物PCR分型法 线性探针杂交（InnoLipa)限制性片段长度多态性分析（RFLP）TRUGENE HCV 5NC Genotyping Assay,HCV 5非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图,5、疾病进展的预测,HBV基因变异与病情,前C/C基因变异,前C1896位(A83)的变异 野毒株1896位是G（甘氨酸），变异为A（丙氨酸），A83氨基酸(TGC)变异为终止密码(TAG)，使前C蛋白的翻译终止，从而使eAg不能合成，临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)，而病人仍处于活动状态的

30、慢性乙型肝炎。,前C/C基因变异的意义,1896位点突变与HBeAg阴性病人体内HBV持续复制有关。,通过检测1896位点基因发现HBeAg阴性的活动性乙肝。,HBV其它变异的临床意义,1814位点突变，与暴发性肝炎有关。1762位点突变，与慢性重症肝炎和肝硬 化有关。1764位点突变型，与慢性重症肝炎和肝 硬化有关。,HCV基因型与临床病情,1b型病毒易使患者导致肝硬化和肝癌；1b型较非1b型易导致严重疾病。,HIV病毒载量与病情进展,通过PCR检测病毒颗粒的数量与疾病的进展有正相关,6、生存期的预测,HIV and AIDS,病毒数量可预测生存时间,7、流行病学,在结核诊断中的应用,1、流

31、行情况 2、结核检测方法的评价 3、引物设计 4、结核杆菌DNA的提取 5、PCR产物的检测 6、PCR在结核病临床诊断中的应用,1.流 行 情 况,结核杆菌可以导致全身性疾病 发展中国家，发病率较高 变异性较大，抗痨药物的耐药性增加 结核病的发病大幅度增高,2.结核检测方法的评价,涂片抗酸染色细菌培养动物接种,特异性高 灵敏度低 耗时长,短期培养后抗原免疫原性分析 放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌。敏感性较高 培养时间长 重复性差,短期

32、培养后核酸探针杂交法 用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.防止培养的假阴性，却易发生假阳性，耗时长，复杂和繁琐，涉及同位素操作之嫌等，PCR方法快速、灵敏、准确,3.引物设计,(1)编码结核杆菌抗原的基因序列,(2)结核杆菌基因组重复序列,克隆DNA序列:MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.检出限在20个结核杆菌以下。插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.在基因组中的拷贝数为1-20个。IS6110是目前进

33、行临床PCR检测的首选区段。,(3)人型结核杆菌特异序列,mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，敏感性达到10fg纯化DNA量.,分枝杆菌共有，但种间又存在差别，能检出10个结核杆菌.可区分结核杆菌和非典型结核杆菌.,(4)分枝杆菌DNAJ基因,(5)rRNA序列,使用RT-PCR扩增，检出限约10个结核杆菌，临床一般少用。,靶序列来源:a.单抗检出的TB抗原蛋白编码基因b.TB特异性核酸片段克隆c.插入序列,65KD，165bp;MPB64，240bp;IS6110，123bp;IS986，245bp;16sDNA，584bp.,举例,4.结核杆菌DNA的提取,标本的前处理 痰的液化 液

34、化剂：二硫苏糖醇/0.5%N-乙酸-L半 胱氨酸+1.45%枸橼酸钠+2%NaOH 血性标本 红细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCl pH7.6,5mmol/LMgCl2,10mmol/LNaCl,结核杆菌DNA的提取(1),细菌裂解方法 蛋白酶K加表面活性剂法 蛋白变性剂加表面活性剂 煮沸法 反复冻融法 超声波法 溶菌酶加表面活性剂法,结核杆菌DNA的提取(2),提取DNA的方法:酚一氯仿提取法:用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，70%乙醇洗涤，尔后干燥，最后用

35、双蒸水洗脱(55).该方法可以消除痰中的某些抑制因子.,5.PCR产物的检测,实时荧光定量 琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察 DNA探针杂交：非放射性标记，如生物素、荧光素 吖啶酯标记探针，用硼酸钠将未杂交 的探针分解，H2O2溶液和NaOH溶液使 吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量。,6.在结核病临床诊断中的应用,1.TB早期菌血症的诊断,2.有利于鉴别诊断:肺结核和肺癌 脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎 肾结核、泌尿生殖系统结核,3.抗痨治疗的评价,4.疫情的检控、发病机理的探讨,准确定量,血液 其他体液痰 起始量一致,5.结核耐药基因,RFP（利福平）INH（异烟肼）SM（链霉素）EMB（乙胺

36、丁醇）PZA（吡嗪酰胺）喹诺酮类,已确定耐药的抗结核药物,单耐药基因检测,耐利福平：突变一般发生在RNA聚合酶B亚单位编码基因（rpoB基因）突变位点：531位 丝氨酸亮氨酸526位 组氨酸酪氨酸突变导致RFP 不能与RNA聚合酶B亚单位结合耐异烟肼：与三种基因突变有关katG基因（突变位点：463位 精氨酸亮氨酸）inhA基因（突变位点：94位 丝氨酸丙氨酸）ahpC基因,同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药大多数耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变所致;靶结构变化与耐药水平有关少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变所致,耐多药基因检测,样品的制备PCR扩增已知的与耐药有关的基因片段扩增产物耐药基因分析SSCP（单链构象多态性分析）RFLP（限制性片段长度多态性分析）DNA序列分析,耐药基因的检测方法,谢谢！,